海洋經濟軟體動物肌肉副肌球蛋白分布特性初探

宋 揚，田元勇，張 晴，周晏琳，袁春紅，劉俊榮

(1.大連海洋大學，食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023； 2.巖手大學 農學部，日本 巖手縣 0208550 )

經濟貝類構成我國最重要的海水養殖產業，2016年我國海水養殖總產量約1.96×107t，其中經濟貝類產量約為1.42×107t，占海水養殖總產量的72%[1]。除傳統加工品外，活品貝類因高品質和高附加值越來越受到消費者歡迎和產業重視?；钇坟愵惖钠焚|除受捕后流通條件影響以外，與肌肉蛋白組分及理化性質有直接的關系，此外，不同經濟品種之間的差異也不可忽視。與脊椎類的魚體肌肉相比，副肌球蛋白為肌原纖維蛋白中主要組分之一，并以副肌球蛋白為核心，再結合肌球蛋白構成粗絲，因此，貝類的肌絲直徑相比于脊椎動物更粗[2]。近些年，對副肌球蛋白結構[3-8]、蛋白表達及氨基酸序列[9-11]、凝膠性及免疫活性等功能特性[12-15]的研究頗多。Yphantis等[16]發現，硬殼蛤(Mercenariamercenaria)副肌球蛋白在提取過程中容易發生降解，提取液中加入0.01 mol/L EDTA，可得到分子量為210 ku的α型副肌球蛋白，而前人采用醇沉法得到的200 ku β型副肌球蛋白，為α型的降解產物。Yeung等[5]進一步證明，β副肌球蛋白是α副肌球蛋白C末端肽鏈部分降解產生。此外，在硬殼蛤肌肉中還發現了副肌球蛋白的聚合物[17]，副肌球蛋白的聚合物是否在所有軟體動物中存在，其為天然形成的還是在提取過程中形成的尚不明確。

副肌球蛋白在貝類肌肉緊張收縮機制中發揮重要作用[18]，也會對貝類死后肌肉的變化產生重大影響，進而影響高端產品如刺身產品的品質。探究副肌球蛋白性質，便于進一步揭示貝類活品品質及死后貝類肌肉狀態變化機理。另外，相對于魚類肌動球蛋白凝膠機理，貝類副肌球蛋白獨特的凝膠特性，在改善肌動球蛋白凝膠方面同樣具有探索價值[13-14]?？傊?，有必要對貝類肌肉中副肌球蛋白的分布及性質進行先期系統研究。

選取菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、毛蚶(Scapharcasubcrenata)、皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannaiino)、脈紅螺(Rapanavanosa)及長蛸(Octopusvariabilis)等5個常見經濟品種作為研究對象，在各品種可食部分的一般組成及特性比較基礎上，重點對肌肉組織副肌球蛋白的分布特性進行初步鑒定，旨在逐步揭示蛋白組分特別是副肌球蛋白與貝類肌肉品質的關聯機制，包括不同品種肌肉品質的差異，以及捕獲后活品品質變化等機理。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

所用化學試劑主要有SDS、聚丙烯酰胺及β-巰基乙醇(美國Sigma公司)。尿素、三羥甲基氨基甲烷、氯化鈉、高氯酸等(國藥集團化學試劑有限公司),所用試劑均為分析純。

所用儀器設備有HG-200高速分散均質機(日本HSIANGTAI公司)、GL-21M高速冷凍離心機(德國HERMLE公司)、AE-6500平板電泳槽(日本ATTO株式會社)、Lambda 25紫外可見分光光度計(珀金埃爾默儀器有限公司)、L-8900全自動氨基酸分析儀(日立高新技術公司)、MALDI TOF/TOF 4800飛行時間質譜儀(AB SCIEX質譜系統公司)。

1.2 原料采集與樣品處理

菲律賓蛤仔、毛蚶、脈紅螺、皺紋盤鮑、長蛸于2016年6月購自大連新長興水產品市場，全部為活品狀態，運到實驗室后立即進行處理。其中，菲律賓蛤仔及毛蚶分別取全部軟體組織，閉殼肌(菲律賓蛤仔)及足肌(毛蚶)，脈紅螺與皺紋盤鮑取肌肉組織，長蛸取外套膜和足部。上述各樣品采取后迅速于-40 ℃下保存待分析。

一般化學組成采用原料可食部位(菲律賓蛤仔、毛蚶全部軟體組織，皺紋盤鮑、脈紅螺除去內臟后軟體組織，長蛸肌肉組織)；氨基酸測定取各樣品肌肉組織(菲律賓蛤仔閉殼肌，毛蚶、皺紋盤鮑、脈紅螺足肌，長蛸外套膜)。

1.3 分析方法

1.3.1 一般化學組成分析

一般化學組成分析包括水分、粗脂肪、粗蛋白、總糖及灰分。分別采用直接干燥法(GB 5009.3—2010)測定水分含量，灼燒稱量質量法(GB 5009.4—2010)測定粗灰分含量，凱氏定氮法(GB 5009.5—2010)測定粗蛋白質含量，索氏抽提法(GB/T 5009.6—2003)測定粗脂肪含量，采用分光光度法(GB 9695.31—2008)測定總糖含量。

1.3.2 氨基酸組成分析

采用酸水解法(GB/T 5009.124—2003)測定樣品中氨基酸含量。分別稱取各種類肌肉樣品0.1 g，加入6 mol/L HCl于蛋白水解管中，吹入氮氣密封后于110 ℃烘箱中水解24 h，采用定量濾紙過濾后，蒸餾水定容至25 mL，取4 mL在真空條件下50 ℃水浴蒸發，用4 mL 0.02 mol/L HCl溶解，稀釋4倍后用0.45 μm濾膜過濾后，用氨基酸自動分析儀測定氨基酸含量，上樣量20 μL。

1.3.3 蛋白質營養價值評價

根據聯合國糧農組織/世界衛生組織專家委員會于1973年推薦的氨基酸評分標準模式(干基)[19]，進行營養價值評定，氨基酸評分(AAS)和必需氨基酸指數(EAAI)按下式計算：

式中，n為比較的必需氨基酸個數，a、b、c、…、g為貝類肌肉蛋白質的必需氨基酸含量(%)，ae、be、ce、…、ge為全雞蛋蛋白質的必需氨基酸含量(%)。

1.3.4 蛋白組成及定量分析

分別稱取5種軟體動物肌肉樣品5.0 g，加入4倍體積0.1 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)緩沖溶液，以30 s為間隔，于10 000 r/min條件下均質3次，每次均質時間為30 s，以上操作在冰水浴中進行。分別取0.02 mL勻漿液，加入2.0 mL蛋白溶解液[含有2% SDS，8 mol/L尿素、2% β-巰基乙醇，50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)]，混勻后于100 ℃加熱5 min。取0.01 mL用于SDS-PAGE分析。濃縮膠質量分數5%，分離膠質量分數7.5%，考馬斯R-250染色，醋酸甲醇溶液進行脫色。使用Multimate Gauge軟件對電泳圖譜進行定量分析。

1.3.5 質譜分析

將SDS-PAGE干膠粒用0.4 mL 0.1 mol/L NH4HCO3/30% ACN脫色液清洗脫色至透明，棄上清液，加入 0.1 mol/L NH4HCO3，室溫孵育15 min。棄上清液凍干，之后加入測序級Trypsin溶液，37 ℃酶解。吸出酶解液，轉移至新EP管中，原管加入100 μL 60% ACN/0.1% TFA,超聲15 min。合并酶解液并凍干，凍干樣品用2 μL 20%乙腈復溶。取1 μL溶解樣品，直接點于樣品靶上，溶劑自然干燥后，再取0.5 μL過飽和CHCA基質溶液，點至對應靶位上并自然干燥。并用串聯飛行時間質譜儀進行測試分析，激光源為355 nm波長的Nd：YAG激光器，加速電壓為2 kV，一級質譜掃描范圍為0～4000 Da，選擇信噪比>50的母離子進行二級質譜(MS/MS)分析。數據使用Uniprot數據庫進行比對分析。

1.3.6 數據處理

每個試驗組均設3個平行，數據用平均值±標準差表示，經SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan氏新復極差檢驗法進行顯著性差異分析處理，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 化學組成特性及氨基酸分布

2.1.1 可食部位的一般化學組成特性

菲律賓蛤仔、毛蚶、脈紅螺、皺紋盤鮑及長蛸5個研究樣本的一般化學組成(干基)分析結果見表1?？傮w來看，均呈現高蛋白低脂肪的基本化學特性，鮮品原料的水分含量為76%～83%，粗蛋白含量為60%～82%，粗脂肪含量低于4%，灰分7%～10%；總糖含量為10%～30%，也呈現了軟體類多糖含量豐富的特征。

2.1.2 肌肉組織的氨基酸分布特性

對5種海洋經濟動物肌肉中氨基酸種類和含量進行分析(表2)。除色氨酸在酸水解處理過程中被破壞未能檢出，幾種原料肌肉中均含有17種氨基酸，并且亮氨酸和賴氨酸在幾種原料中的含量均較高，原料間無顯著差異。非必需氨基酸中，丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸及谷氨酸含量較高，谷氨酸最多，含量為2.58～3.31 g/100 g。根據必需氨基酸評分，菲律賓蛤仔和毛蚶必需氨基酸指數分別為51.75、56.13。脈紅螺、皺紋盤鮑、長蛸必需氨基酸指數分別為62.82、64.04、72.48。纈氨酸為菲律賓蛤仔、脈紅螺、長蛸、皺紋盤鮑的第一限制性氨基酸，甲硫氨酸+半胱氨酸為毛蚶第一限制氨基酸。幾種原料必需氨基酸/總氨基酸接近世界衛生組織/國際糧農組織推薦的模式35.38%，是優質食用蛋白源(表3)。

表1 5種海洋經濟動物可食部位的一般化學組成 %

注：大寫字母代表不同原料間濕基差異顯著(P<0.05)，小寫字母代表不同原料間干基差異顯著(P<0.05).其他表同.

表2 5種海洋經濟動物肌肉蛋白的氨基酸組成比較 g/100 g濕基

注：**必需氨基酸.

表3 5種海洋經濟動物肌肉蛋白必需氨基酸評分比較

2.2 肌肉組織的蛋白組成與分布

2.2.1 肌肉蛋白組分分析

對5種海洋經濟動物肌肉組織進行蛋白組成分析(圖1)。結果表明，其共性特征體現在，均含有肌動蛋白(44.3 ku附近)、副肌球蛋白(97.2 ku附近)、肌球蛋白(200 ku附近)及肌球蛋白輕鏈等重要蛋白組分，此外，還含有水溶性蛋白條帶。不同品種間肌肉蛋白組成的差異體現在未知蛋白聚合物上(200 ku以上)，除頭足類(長蛸)外，其余4種均出現分子量高于肌球蛋白(200 ku)的蛋白聚合物條帶，從分子量估算，其極有可能是副肌球蛋白聚合體，后續對該條帶進行了分析鑒定(見2.3)；此外，值得關注的是，副肌球蛋白分子量的大小表現出品種間的差異，有待進一步探究。

2.2.2 肌肉蛋白組分的定量分析

進一步對5種海洋經濟動物肌肉的蛋白組成進行定量分析(表4)。結果表明，肌球蛋白在毛蚶、長蛸、皺紋盤鮑中占比均大于20%，菲律賓蛤仔和脈紅螺則為17%～18%；肌動蛋白含量平均約30%，其中毛蚶足肌中占比最大為38.74%，菲律賓蛤仔占比最小，為21.63%；副肌球蛋白單體在皺紋盤鮑、脈紅螺、長蛸中含量約為25%，在毛蚶和菲律賓蛤仔肌肉中占比分別為17.08%、19.88%；此外，菲律賓蛤仔、毛蚶及皺紋盤鮑還分布有分子量高于200 ku的蛋白聚合物(2.3部分鑒定為副肌球蛋白聚合體)，占比分別為7.47%、15.94%及15.31%?？傮w而言，副肌球蛋白在菲律賓蛤仔、毛蚶及皺紋盤鮑肌肉組織中含量比較豐富，依次為27.35%、33.02%和35.22%。

圖1 5種海洋經濟動物肌肉蛋白的SDS-PAGE分析a.標準蛋白； b.菲律賓蛤仔； c.毛蚶； d.皺紋盤鮑； e.脈紅螺； f.長蛸.

2.3 副肌球蛋白的質譜分析與鑒定

菲律賓蛤仔、毛蚶、皺紋盤鮑以及脈紅螺均在肌球蛋白條帶上方出現未知蛋白條帶，依次為圖1中所示1、3、5、7；為進一步分析鑒定疑似副肌球蛋白聚合物的未知條帶，結合副肌球蛋白條帶(圖1中2、4、6、8)進行質譜分析。

以菲律賓蛤仔為例，未知蛋白聚合物(條帶1)和副肌球蛋白(條帶2)在蛋白總分可信度高于95%條件下，均能夠與同種副肌球蛋白匹配，覆蓋率分別為23%和19%(表5)，且從SDS-PAGE的移動距離可計算副肌球蛋白(條帶2)分子量，為101.4 ku，未知蛋白聚合物(條帶1)蛋白分子量為211.0 ku，由此，推測該未知蛋白聚合物即是副肌球蛋白聚合體(aPM)。同樣，推定毛蚶(條帶3)與皺紋盤鮑(條帶5)為副肌球蛋白的聚合體。

表4 5種海洋經濟軟體動物肌肉蛋白組成分析結果 %

注：*未知蛋白條帶經質譜分析為副肌球蛋白聚合體；**經質譜分析非副肌球蛋白聚合體.

表5 5種海洋經濟軟體動物肌肉組織中副肌球蛋白的分析鑒定

注：*長蛸，經分析鑒定，不含副肌球蛋白聚合體條帶；**脈紅螺，經分析鑒定，聚合體條帶未鑒定為副肌球蛋白.

3 討 論

相對于脊椎魚類，副肌球蛋白在無脊椎動物中的分布具有突出的特點，也曾受到不同領域學者的關注。副肌球蛋白的研究始于20世紀初，起初研究主要以雙殼貝類閉殼肌為研究對象，20世紀40年代中期獲得命名“副肌球蛋白”[20]，20世紀70年代，一些小型環節動物門和線性動物門的副肌球蛋白研究較為活躍[21-22]。在此之后20年間陸續有關于水產經濟動物的研究。Melson等[23]對幾種軟體動物肌肉副肌球蛋白提取發現，含有0.01 mol/L EDTA與不含EDTA提取的硬殼蛤(Mercenariamercenaria)副肌球蛋白分子量相差7 ku，但是對美洲牡蠣(Crassostreavirginica)、左旋香螺(Busyconcontrarium)、西印度石鱉(Acanthopleuragranulata)無影響；Mykles[24]研究了美洲螯龍蝦(Homarusamericanus)肌肉中蛋白組分，發現肌球蛋白重鏈分子量為175 ku、肌動蛋白分子量為41 ku、原肌球蛋白34 ku、副肌球蛋白分子量為96～99 ku；Costello等[25]研究表明，美洲螯龍蝦不同組織肌肉中副肌球蛋白分子量分別為105 ku和110 ku；Sonobe等[3]報道，副肌球蛋白廣泛存在于海參、海膽等后口動物平滑肌中，但脊椎動物中無論平滑肌還是橫紋肌均沒有副肌球蛋白，在無脊椎動物向脊椎動物過渡態的文昌魚肌肉中不含副肌球蛋白，但在文昌魚脊索中檢測到了副肌球蛋白，其在進化過程中副肌球蛋白表達受到抑制，進而在進化過程中逐漸消失。到近些年才有關于副肌球蛋白功能性在原料學屬性方面的研究[14-15,26]?？傮w來講，有關水產經濟類的研究缺乏系統連續性。

5種海洋經濟軟體動物蛋白分布呈現差異性，不同品種間蛋白組成差異可能影響肌肉蛋白的功能性。Fukuda等[14,27]研究表明，副肌球蛋白比肌動球蛋白具有更好的凝膠強度。當溫度大于55 ℃，副肌球蛋白凝膠比肌動球蛋白具有更好的彈性，尤其在80 ℃，盡管蛋白含量很低，副肌球蛋白凝膠韌性遠大于肌動球蛋白。王帥[28]等報道，鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)肌肉添加扇貝閉殼肌后，能明顯地提高產品的凝膠強度。

菲律賓蛤仔、毛蚶、皺紋盤鮑肌肉中含有副肌球蛋白聚合體，關于副肌球蛋白聚合體的形成機制目前尚未見報道，為探討是否為樣品處理過程導致單體發生聚合，將菲律賓蛤仔閉殼肌直接用蛋白變性劑處理后進行SDS-PAGE分析，電泳結果顯示，同樣存在副肌球蛋白聚合體的條帶，由此初步推測副肌球蛋白聚合體可能為天然存在。Watabe等[18,29]對硬殼蛤閉殼肌磷酸化研究發現，肌原纖維蛋白中只有副肌球蛋白聚合體能被內源性激酶磷酸化。此外，還證明了磷酸化位點位于副肌球蛋白C末端?！癈atch”肌肉中副肌球蛋白磷酸化水平高于非“Catch”肌肉。聚合體的形成是否與磷酸化機制有關值得進一步探索。

經濟軟體動物肌肉蛋白組分具有動物源蛋白的共性，均含有肌球蛋白、肌動蛋白、副肌球蛋白及原肌球蛋白等主要蛋白組分。副肌球蛋白對軟體類肌肉蛋白功能性質的影響值得關注，一方面，副肌球蛋白在軟體類中含量十分顯著，另一方面，副肌球蛋白的分布特性具有品種的差異性。本研究為揭示蛋白組分特別是副肌球蛋白與貝類肌肉品質關聯機制的前期工作，進一步的研究將在不同品種肌肉品質的差異以及捕獲后活品品質變化機理等方面開展。