達托霉素新雜質及其來源研究

夏興 邵東 孫新強,*

(1 上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司，上海 200240；2 浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠，新昌 312500)

達托霉素是一種由13個氨基酸組成的新型脂肽類抗生素，是一種鈣離子依賴型的抗生素。在鈣離子存在的條件下，它將以非共價鍵的形式與細胞膜上達托霉素結合蛋白(DBPs)結合。達托霉素由微生物玫瑰孢鏈霉菌發酵生成的，具有在體外抗絕大多數的臨床革蘭陽性菌的作用，包括厭氧菌、腸球菌等耐藥菌，且主要用于耐藥菌，如耐萬古霉素的腸球菌(VRE)，耐甲氧西林金葡菌(MRSA)等，在醫學方面具有廣闊的應用前景[1-2]。

達托霉素的化學結構復雜，結構如圖1所示，其生產、純化、運輸、保藏環節的條件變化均會導致雜質的產生，影響產品質量和治療效果。為評價藥物的安全性、雜質的生物學影響，必須對相關雜質的結構進行確證。同時，在進行達托霉素申報注冊時也需要說明相關雜質的來源，因此對相關雜質的研究十分重要。本文在研究達托霉素相關雜質過程中[3]，發現了一個未知雜質。通過高效液相分離純化了該雜質，并進行UPLC-MS和NMR測定，推定了其結構。根據其化學結構，檢測了生產原料，推測了其可能的來源。

1 儀器和試劑

Aglient 1100液相系統(美國Aglient)；質譜儀：ACQUITYTMUPLC & Q-TOF MS Premier(美國Waters)；核磁共振儀：Bruker Avance III 400MHz(德國Bruker)；GC-MS：安捷倫7890A-5975C(美國Aglient)。

達托霉素(浙江醫藥股份有限公司，批號：306DT150301)；癸酸：杭州油脂化工(批號：20170321009)；乙腈購于百靈威化學技術有限公司，色譜純；硅烷化試劑購于上海安普科技；其他試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 HPLC分析方法

按照文獻方法進行HPLC分析[4]。色譜柱：菲羅門C8，IB-SIL(4.6mm×250mm, 5μm) C8柱；柱溫：25℃(22～28℃)；檢測波長：214nm；流速：1.5mL/min；進樣量：20μL。

流動相：A相0.45% NH4H2PO4中的20%乙腈，pH 3.25；B相0.45% NH4H2PO4中的50%乙腈，pH 3.25。目標流動相為35%乙腈于0.45% NH4H2PO4中，使得達托霉素的保留時間維持在(36.0±1.5)min，如有偏差，可通過調節A、B相，使保留時間在合理范圍內。

溶液配制：精密量適量達托霉素樣品，加A相和B相(1:1,V/V)流動相，制成含達托霉素1mg/mL?；靹?，進行HPLC分析。

2.2 相關雜質的制備方法

利用HPLC對進行雜質制備，制備條件沿用HPLC分析條件。對達托霉素樣品中各個雜質目標峰進行收集。收集的各個雜質溶液-18℃冷凍保存。等累計到一定量后，合并相同組分。減壓薄膜濃縮去除有機溶劑，冷凍干燥，獲得含有雜質和鹽的混合物。使用無水甲醇溶解含上述各個雜質的混合物，過濾去除不溶于甲醇的鹽，獲得的溶液進行減壓濃縮，獲得比較純的雜質樣品。

2.3 UPLC-MS分析方法

方法：ESI源，正離子。毛細管電壓為3.0kV，錐孔電壓35V，源內溫度100℃，干燥氣流溫度250℃，干燥器流速400L/h; 碰撞能MS 6eV、MS-MS 35eV，質量掃描范圍m/z80～2000，掃描時間1s，掃描間隔時間0.02s，樣品濃度1mg/mL。

2.4 NMR檢測方法

樣品溶于0.5mL DMSO-d6中，進行核磁共振掃描。采用Bruke Avance III 400MHz配5mm BBOF探頭，觀察頻率100MHz，掃描范圍-20～220ppm，30度脈沖角，采樣時間0.68s，延遲時間2s，掃描次數5120次，測定溫度300K。

2.5 癸酸的GC-MS分析方法

癸酸樣品，熔融后取100μL于氣相頂空瓶中，加入900μL硅烷化試劑，封閉后70℃靜置1h。進行GC-MS分析。

圖1 達托霉素結構圖Fig.1 The structure of daptomycin

G C-M S方法：色譜柱：D B-5(30m×0.25mm×0.25μm)；進樣量：0.2μL；進樣溫度：270℃；分流比：100:1；載氣：氦氣(99.999%)；流量：1mL/min；柱溫：40℃保持3min，以10℃/min升至300℃，保持8min；接口溫度：270℃；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；電離方式：EI+，70ev；檢測器電壓：2200V；掃描方式：全掃描；質量范圍：20～500；NIST 2014譜庫。

3 實驗結果

3.1 HPLC分析結果

所述的方法，對達托霉素進行了分析，發現達托霉素樣品中雜質較多，主要含有10個雜質。HPLC圖譜參見圖2。針對這些雜質，進行了分離純化。其中，保留時間30.1min(相對保留時間RRT為0.82)處的雜質為新雜質。

3.2 MS鑒定結果

采用全掃描一級質譜，并進一步對新雜質進行碰撞誘導解離實驗，得到一級、二級質譜圖，一級MS和二級MS見圖3～4。

圖2 達托霉素HPLC圖Fig.2 HPLC profile of daptomycin

圖3 新雜質MS圖Fig.3 MS spectra of new impurity

按照文獻[5]的方法，本研究進行新雜質MS-MS的解析。新雜質MS-MS片段模式如圖5所示。正離子模式下，新雜質的[M+H]+準分子離子峰為m/z1618.6995，元素組成為C72H100N17O26；m/z809.8456為[M+2H]2+峰；m/z1280.51為雜質脫去脂肪?；鶄孺満蜕滨５钠?。其他主要的MS-MS數據參見表1。MS-MS顯示，y1～y12的離子碎片與達托霉素的一致；b離子與達托霉素相比，碎片峰都比達托霉素的b離子小2。推測該化合物為在癸?；鶄孺溕闲纬呻p鍵。

3.3 NMR鑒定結果(表2，圖6～7）

為進一步確證側鏈結構，進行了核磁共振分析。13C NMR圖譜參見圖6；1H NMR圖譜參見圖7。核磁共振圖譜的歸屬見表2。

圖4 新雜質MS-MS圖Fig.4 MS-MS spectra of new impurity

圖5 新雜質結構和MS-MS片段模式Fig.5 Chemical structures of new impurity and its MS-MS fragmentation patterns

表1 新雜質的MS-MS序列數據分析Tab.1 Ions observed in MS-MS sequence analysis of new impurity

表2 13C NMR和1H NMR在DMSO-d6中數據Tab.2 1H NMR and 13C NMR Data for new impurity in DMSO-d6

圖6 新雜質13C NMR圖Fig.6 13C NMR spectra of new impurity

按照文獻[5]的方法，我本研究進行新雜質核磁共振譜圖的解析。相比達托霉素而言，在13C NMR上，于123.59和132.98ppm處有2個信號，屬于烯鍵，同時在28ppm處，少了2個信號峰。結合1H NMR、推測在側鏈的3,4位形成了雙鍵。因此推測該雜質的結構，為N-(3-癸烯?；?-L-色氨?；?D-天冬酰胺?；?L-天冬氨?；?L-蘇氨?；?甘氨?；?L-鳥氨?；?L-天冬氨?；?D-丙氨?；?L-天冬氨?；?甘氨?；?D-絲氨?；?蘇-3甲基-L-谷氨?；?L-3-鄰氨基苯甲?；?L-丙胺酸-ε1-內脂，其與達托霉素的主要區別在于側鏈的3,4含有雙鍵。

3.4 癸酸GC-MS分析結果(圖8～9，表3)

采用ACD lab軟件處理GC-MS數據。GC-MS的離子流參見圖8。

圖7 新雜質1H NMR圖Fig.7 1H NMR spectra of new impurity

圖8 硅烷化癸酸離子流圖Fig.8 Ion flow spectra of silanized decanoic acid

在硅烷化癸酸的離子流圖中，主要有3個離子峰。其中組分為硅烷化癸酸。在12.56min，有一個微量物質，其MS圖參見圖9。分子量顯示，其比硅烷化癸酸少2Da，為硅烷化癸烯酸(表3)。

GC-MS結果顯示，癸酸樣品中主要成分為癸酸，主要雜質為辛酸、壬酸。并且在樣品中發現癸烯酸。

GC-MS分析結果表明，雜質為發酵過程中補加癸酸時癸酸中含有少量的癸烯酸所致。因此，想要控制雜質，需在發酵過程中控制癸酸質量。

4 討論

圖9 硅烷化癸烯酸MS圖Fig.9 MS spectra of silanized decenoic acid

表3 硅烷化癸酸樣品主要成分Tab.3 Major component of silanized decanoic acid

肽類化合物結構復雜，由于之間為肽鍵相連，通過核磁分析很難確定連接關系。而質譜分析所形成的一系列碎片卻對肽鍵連接順序分析十分有效。Cubist曾經報道過一個分子量為1618的雜質，與我們分離到的新雜質分子量一致，但是Cubist并沒有明確其結構[4,6]。本文在達托霉素研究的基礎上，利用UPLC-MS和NMR分析了達托霉素新分離到的雜質。測試結果表明，該雜質與達托霉素的區別在于側鏈上有烯鍵，進一步的研究結果表明，發酵原料癸酸中含有的微量癸烯酸是該雜質形成的可能原因。因此，認為在發酵過程中，控制起始原料癸酸的質量，可以控制該雜質的含量[7]。