GC-FID 預測相對響應因子法測定卷煙爆珠中辛,癸酸甘油酯含量

劉珊珊，鄧惠敏，楊 飛，吳晶晶，王 穎，范子彥，李小蘭*，李中皓*，邊照陽，唐綱嶺

1. 國家煙草質量監督檢驗中心，鄭州市高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

2. 廣西中煙工業有限責任公司，南寧市北湖南路28 號 530001

近年來，爆珠型卷煙在國內外市場發展迅速[1-2]。卷煙爆珠是用成膜材料制成的球形囊狀物，由一層壁材外殼包裹液體芯材制成。其中，壁材一般為明膠類物質，芯材一般為香味物質的中鏈甘油三酯混合溶液[3-4]。作為卷煙爆珠中香味成分的主要稀釋劑和增溶劑，食品添加劑辛,癸酸甘油酯（ODO）的應用最為普遍[5-6]。由于ODO 在卷煙爆珠中質量占比高，因此ODO 含量（質量分數）往往是卷煙爆珠及其微量復雜香味成分穩定性、均勻性等產品質量評價的重要指征指標，而且由于ODO 具有較強的脂溶性，因此ODO 也可能是降低卷煙煙氣脂溶性有害成分釋放量的重要影響因素[7]。

食品中ODO 的相關定量檢測方法主要為氣相色譜（GC-FID）分析方法[8]和氣相色譜質譜聯用（GC-MS）法[9]，但涉及的指標僅包括單辛酸甘油酯、單癸酸甘油酯。從ODO 的結構式RCOOCH2CH（OCOR）CH2OCOR（R 為C8H17或C10H21）可以看出，ODO 是多種化合物的混合物，由于部分化合物目前在市場上不易購得高純度的標準品，因此制約了基于對應標準品的傳統校準定量方法的應用。

氫火焰離子化檢測器（FID）通過熱氫解作用使有機化合物轉化為CHO+，信號響應值與化合物的碳原子數目成正比[10-11]。由于并非所有的碳原子都能最終轉化為CHO+，因此通過氣相色譜FID檢測器相對響應值而得到的化合物的有效碳原子數即為有效碳數（Effective Carbon Number，ECN）。1962 年，Sternberg 等[12]提出了基于分析物分子結構預測其在FID 的相對響應因子（Relative Response Factor，RRF）的分析 方 法，即ECN 法。Jones[13]和Jorgensen 等[14]對這種方法的有效性進行了驗證。范國梁等[15]和Szulejko 等[16]將該方法用于無標準樣品的定量檢驗領域，也取得了良好的應用效果。但是目前國內外均未見采用該方法測定卷煙爆珠中ODO 含量的研究報道。因此，建立卷煙爆珠中ODO 含量的GC-FID 定量方法，探討ECN 預測RRF 方法在ODO 多組分混合物定量分析中應用的可行性，旨在為卷煙爆珠產品的質量評價提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

8 種不同加香類型的卷煙爆珠樣品，由廣西中煙工業有限責任公司提供。

三辛酸甘油酯（≥99%）、十六碳烷（98.5%）（北京百靈威科技有限公司）；三癸酸甘油酯[＞98%，梯希愛（上海）化成工業發展有限公司]；正己烷（色譜純，上?？泼鸦瘜W科技有限公司）；ODO[食品級，道勤生物科技（上海）有限公司]。

7697A 頂空自動進樣器、7890B 氣相色譜儀（配FID 檢測器）、7890B/5977A 氣相色譜/質譜聯用儀、DB-5MS UI毛細管柱（15 m×0.25 mm×0.25 μm）（美國Agilent 公司）；AE163 電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler-Toledo 公司）；Balston 氫氣發生器（美國Parker 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液與內標溶液的配制

采用正己烷作為溶劑，配制三辛酸甘油酯、三癸酸甘油酯和內標正十六烷的單一標準儲備液，質量濃度分別為2.5、2.5 和25 mg/mL。參考物質（三辛酸甘油酯或三癸酸甘油酯）系列標準工作溶液的配制：分別移取0.025、0.500、1.000、1.500 和2.000 mL 的參考物質單一標準儲備液于10 mL 容量瓶中；加入內標儲備液100 μL，以正己烷定容；每級系列標準工作曲線中參考物質的質量分別為0.062 5、1.250 0、2.500 0、3.750 0 和5.000 0 mg。

1.2.2 樣品處理和分析

爆珠樣品：取1 粒爆珠樣品稱量，精確至0.1 mg，置于剪裁過的3 mL 塑料吸管中，擠破爆珠后，將含有擠破爆珠的塑料吸管一并放入50 mL 離心管中，加入10 mL 正己烷和100 μL 內標儲備液，于1 000 r/min 的轉速下渦旋振蕩5 min，取約2 mL 上清液進行GC 分析。

含爆珠的濾嘴樣品：將卷煙濾嘴拆下后，捏破濾嘴中的爆珠，將濾嘴置于50 mL 離心管中，加入10 mL 正己烷和100 μL 內標儲備液，超聲萃取60 min，取約2 mL 上清液進行GC 分析。

1.2.3 GC-FID 條件

色譜柱：DB-5MS UI 柱；進樣口溫度：325 ℃；載氣：氦氣（99.999%）；恒流模式；柱流速：1.0 mL/min；進樣體積：1.0 μL；分流比：25∶1；程序升溫：180 ℃保持1 min，以30 ℃/min 升溫至300 ℃，保持15 min；總運行時間：20 min；檢測器溫度：300 ℃；尾吹氣：氮氣（99.999%），30 mL/min；空氣：400 mL/min；氫氣：40 mL/min。

1.2.4 GC-MS 條件

GC 條件與1.2.3 節相同。MS 傳輸線溫度：300 ℃；電離方式：電子轟擊源（EI）；電離能量：70 eV；離子源溫度：280 ℃；四極桿溫度：150 ℃；檢測方式：全掃描監測模式（SCAN）；掃描范圍：29～600 amu。

1.2.5 定量分析

分別以三辛酸甘油酯和三癸酸甘油酯作為參考物質（Reference Compound，RM），按照公式（1）計算獲得ODO 各組分單位摩爾質量相對響應因子（RRFi）。

式中：R RFi為分析物i 單位摩爾質量相對響應因子；MWi為分析物i 摩爾質量，g/mol；MWR為參考物質摩爾質量，g/mol；ECNR為參考物質的有效碳數（表4）；ECNi為分析物i 的有效碳數。

以正十六烷為內標，采用內標法計算ODO 總量，按照公式（2）計算：

式中：wODO為ODO 總量，mg；RRFi為分析物i單位摩爾質量相對響應因子；Ai為樣品中分析物i響應峰面積；AIS（i）為樣品中內標物響應峰面積；kR為參考物質標準工作曲線斜率。

2 結果與討論

2.1 ODO 各組分的定性

ODO 混合物可能包括7 大類組分[17]，除了三辛酸甘油酯和三癸酸甘油酯之外，其他5 類物質均至少存在2 種以上同分異構體，ODO 各組分如表1 所示。按照1.2 節方法對食品添加劑ODO 的正己烷稀釋溶液進行檢測，得到ODO 的色譜圖（圖1），確定了ODO 混合物各組出峰順序和保留時間。采用相同的氣相色譜條件，對ODO 混合物進行GC-MS 全掃描分析，所有組分的質譜圖見圖2?？梢钥闯?，在食品添加劑ODO 中，甘油三酯的色譜峰（三辛酸甘油酯、單癸酸二辛酸甘油酯、單辛酸二癸酸甘油酯和三癸酸甘油酯）在FID 上響應值較高，而甘油二酯（二辛酸甘油酯、單辛酸癸酸甘油酯、二癸酸甘油酯）含量較低。

表1 辛,癸酸甘油酯化合物信息Tab.1 Information of ODO components

圖1 辛,癸酸甘油酯氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of ODO obtained by GC-FID

圖2 辛,癸酸甘油酯檢出組分的質譜圖Fig.2 Mass spectrogram for detectable components in ODO

2.2 超聲萃取時間的優化

直接將濾嘴中爆珠捏破并進行萃取時，為了保證將爆珠中的辛,癸酸甘油酯萃取完全，對超聲萃取的時間進行了優化，結果見圖3?？梢钥闯?，當超聲萃取60 min 后，基本達到萃取平衡。

圖3 超聲時間對辛,癸酸甘油酯提取量的影響Fig.3 Influence of ultrasonic time on extraction efficiency of ODO

2.3 ECN 和RRF 的計算

本研究中，按照ECN 計算規則[18]對ODO 各ECN 進行了計算。ODO 各組分化合物存在的官能團包括酯和醇兩種。其中，酯對ECN 的影響為-1.25；伯醇、仲醇、叔醇對ECN 的影響分別為-0.60、-0.75、-0.25?？紤]到甘油二酯會存在伯醇和仲醇兩種同分異構體的情況，為簡化定量處理，將伯醇和仲醇對碳數影響的平均值（-0.675）作為醇對ODO 碳數的影響值。得到的ODO 各化合物ECN 值見表2。分別以三辛酸甘油酯和三癸酸甘油酯作為參考物質，按照1.2 節公式（1）計算所獲得的ODO 各組分單位摩爾質量相對響應因子（RRFi），如表3 所示，化合物結構與參考物質越接近，則RRFi的值越接近1.00。

2.4 參考物質的標準工作曲線

取5 級系列標準工作溶液進行GC-FID 分析，以各標準工作溶液中參考物質峰面積AR與內標物峰面積AIS（R）之比為縱坐標，以各標準工作溶液中參考物質的含量（mg）為橫坐標，繪制參考物質的標準工作曲線（強制過原點）。標準工作曲線的擬合結果（圖4）表明，參考物質在0～0.5 mg/mL 濃度范圍內均具有良好的線性關系，R2大于0.997。三辛酸甘油酯和三癸酸甘油酯參考物質標準工作曲線斜率（kR）分別為0.307 2 和0.316 7。

表2 辛,癸酸甘油酯化合物ECN 值Tab.2 Calculation of ECN for separated components from ODO

表3 辛,癸酸甘油酯各組分RRFi值Tab.3 Calculation of RRFi for separated components from ODO

圖4 參考物質標準工作曲線Fig.4 Calibration curves of reference compounds

2.5 食品添加劑ODO 含量的驗證

以食品添加劑ODO 作為研究對象，分別準確移取0.25、0.50、1.00 mL 的19.91 mg/mL ODO 正己烷溶液于3 個10 mL 容量瓶中，再分別添加100 μL內標溶液，定容后得到低、中、高3 個不同濃度水平的ODO 稀釋溶液。按照1.2 節GC-FID 檢測條件進行儀器分析，每個濃度水平下平行測定3 次，獲得的Ai和AIS（i）如表4 所示。按照1.2 節公式（2）計算ODO 總含量，從定量結果（表5）可以看出，當采用三辛酸甘油酯和三癸酸甘油酯作為參考物質時，3 個含量水平ODO 總量計算結果與配制溶液實際濃度的相對偏差小于3.5%?？梢?，采用GC-FID 有效碳數預測相對響應因子內標法對ODO 各組分進行定量分析具有可行性。

表4 3 個濃度下辛,癸酸甘油酯色譜峰面積檢測結果（n=3）Tab.4 Determination results of peak areas of ODO detected at three concentrations levels（n=3）

表5 3 個濃度下辛,癸酸甘油酯含量檢測結果Tab.5 Determination results of ODO contents at three concentration levels

2.6 卷煙爆珠中ODO 定量檢測的方法學評價

按照1.2 節樣品前處理條件，以食品添加劑ODO 為加標物，對實際卷煙爆珠樣品進行3 水平加標回收率和精密度實驗，每個加標水平重復測定5 次，回收率和精密度結果如表6 所示?？梢钥闯?，在采用三辛酸甘油酯或三癸酸甘油酯作為參考物質的條件下，卷煙爆珠中ODO 含量的加標回收率在98.0%～108.0%之間，RSD≤2.0%。通過逐級稀釋標準樣品溶液，并按信噪比S/N=10 計算得到分析方法ODO 各組分的定量限（LOQ）為0.05 mg/mL。

表6 方法回收率和精密度①（n=5）Tab.6 Recovery and accuracy of this method（n=5） （%）

2.7 實際樣品檢測結果

對廣西中煙工業有限責任公司所提供的8 個卷煙爆珠樣品進行檢測，結果如表7 所示。實際樣品檢測結果表明：8 個卷煙爆珠中均檢出了ODO，含量在23%～87%之間；在卷煙爆珠ODO 各組分中，甘油三酯4 個組分的含量占比在93%以上，甘油二酯3 個組分占ODO 總量的6%左右；分別以三辛酸甘油酯和三癸酸甘油酯為參考物質時，所得辛,癸酸甘油酯含量的一致性較好，平均相對偏差≤2.5%。

表7 卷煙爆珠實際樣品檢測結果Tab.7 Results of ODO content in breakable capsules in commercial cigarette samples （%）

3 結論

建立了ODO 各組分以及卷煙爆珠中ODO 含量的GC-FID 定量分析方法，結果表明基于分析物ECN 預測RRF 法定量分析ODO 混合物組分是可行的。本方法僅需要采用三辛酸甘油酯或三癸酸甘油酯作為參考物質，解決了ODO 混合物多組分標準品不易獲得的問題；在0～0.5 mg/mL 范圍內，工作曲線的R2＞0.997，加標回收率為98.0%～108.0%，RSD≤2.0%，ODO 各組分的LOQ 為0.05 mg/mL。8 個不同加香類型爆珠樣品中ODO 含量為23%～87%，其中甘油三酯占比在93%以上，甘油二酯占比在6%左右；采用兩種參考物質的計算結果的一致性良好。本方法前處理簡單、測定結果準確，可為食品添加劑ODO 組分定量，以及卷煙爆珠相關質量分析提供方法參考。