Ki-67、p16及EGFR表達與老年宮頸癌手術患者預后的相關性

馬淑云 雷潔 張欣 賈澄輝 張青青 周婷 鄧曉紅

(1西安醫學院第一附屬醫院/全科醫學院臨床實驗教學中心/婦產科，陜西 西安 710077；2西北婦女兒童醫院婦產科)

宮頸癌是女性惡性腫瘤疾病之一，死亡率在女性惡性腫瘤中居第二位，且發病年齡越來越呈現出年輕化趨勢〔1〕。Ki-67是一種增殖細胞核抗原，是與細胞周期相關的蛋白質，其功能與有絲分裂有關，是多種惡性腫瘤疾病重要生物標志之一，通過檢測Ki-67抗原，能夠了解惡性腫瘤的細胞增殖活性，可作為疾病不良預后因素，對疾病診斷治療及預后評價有著重要的參考價值〔2,3〕。p16基因又稱為MTS1基因，該基因直接參與細胞周期調控，承擔調節細胞分裂與增殖的作用，宮頸癌患者常伴人乳頭瘤病毒(HPV)感染，HPV病毒表達E7蛋白將結合Rb蛋白誘使Rb蛋白失活，失活后的Rb蛋白將對p16基因產生反饋性刺激，導致其表達升高，故p16表達的升高可能與患者預后存在一定聯系〔4,5〕。表皮生長因子受體(EGFR)是酪氨酸激酶信號傳導通路上的一種蛋白，由原癌基因活化后產生，該蛋白在正常組織與腫瘤疾病中均有表達，與腫瘤發生發展有著密切聯系，現有報告指出，90%的宮頸癌患者存在EGFR蛋白過度表達，故該蛋白可能與宮頸癌患者的預后也有一定相關性〔6～8〕。本研究檢測了老年宮頸癌患者術后病理標本中的Ki-67、p16、EGFR蛋白表達，并分析了患者臨床資料，旨在探討Ki-67、P16、EGFR表達與患者預后的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 在獲得西安醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會批準后，選取2012年5月至2018年9月接受宮頸癌根治術治療的老年宮頸癌患者50例為研究對象，患者及其家屬對本次研究知情，并簽署知情同意書。年齡60～87〔平均(71.24±5.69)〕歲；國際婦產科協會(FIGO)腫瘤分期：ⅠB期16例，ⅡA期21例，ⅡB期13例；經術后病理證實：2例為高分化期(G1級)，31例為中分化期(G2級)，17例低分化期(G3級)。年齡：60～65歲3例，66～74歲25例，75～85歲18例，>85歲4例；民族：漢族40例，其他10例；腫瘤直徑<10 cm者30例，≥10 cm且≤20 cm者11例，20 cm<且≤30 cm者6例，>30 cm者3例；治療方法：單純手術16例，術后化療7例，術后放療9例，術后放化療18例。

1.2入選標準

1.2.1納入標準 ①全部患者手術切除組織經甲醛溶液固定，并使用白蠟包埋，每個蠟塊均實施3～4 μm連續切片并行免疫組化染色；②收集組織白蠟標本均經術后病理證實為明確的宮頸鱗狀細胞癌；③患者無其他惡性腫瘤疾??；④患者病變區域在術前均未接受其他放化療。

1.2.2排除標準 ①其他黏液樣癌、腺癌等；②合并皮肌炎、哮喘、系統性紅斑狼瘡等自身免疫系統疾病者；③有宮頸癌根治術手術禁忌者；④需要接受根治性放化療治療者；⑤伴腦梗死、心力衰竭、腎臟損害等基礎疾病者。

1.3方法

1.3.1治療方法 全部患者接受全麻下廣泛性子宮切除術與盆腔/腹主動脈淋巴結清掃術。對于術后具有高復發因素的患者應實施全盆化療，包括盆腔淋巴結轉移、宮旁組織浸潤、宮頸深肌層侵犯、手術范圍不足或手術切緣陽性者。一般盆腔放療劑量應控制在4 500～5 000 cGy，若患者存在腹膜后區淋巴結轉移，給予腹膜后區至少50 Gy的照射劑量。使用直線加速器6 MV X射線進行外照射，照射方式為適形放療或調強放療。若患者瘤體直徑較大，或發現盆腔淋巴結轉移、手術前切緣陽性、侵及淋巴脈管間隙、低分化腫瘤及宮旁浸潤者，手術前后均給予患者化療治療，化療實施具體方案：75 mg/m2順鉑，分3次靜滴，1次/d；聯合1 mg/(m2·24 h)5-氟尿嘧啶持續微量泵泵入4 d。

1.3.2檢測方法 病理組織標本取材后，使用10%甲醛溶液將標本固定，石蠟包埋后待實施免疫組織化學染色。使用鏈霉素親和生物素-過氧化酶免疫組化法(SP)切割組織標本，厚度3～4 μm，將切割好的標本放入溫度為80℃烤箱中烤至30 min，脫水水化后，經檸檬酸高壓蒸汽140℃緩沖液修復，經處理滅活內源性過氧化物酶；反復使用磷酸鹽緩沖液進行沖洗至少3次，向內加入經1∶100稀釋的濃縮型鼠抗人單克隆Ki-67，并置于4℃冰箱內；過夜使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，加入試劑盒生物素相關二抗，再使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次。經二氨基聯苯胺工作液溫顯色，使用顯微鏡觀察，后利用蘇木素復染，經1%鹽酸乙醇分化5 s后使用流水沖洗約5 min；使用梯度乙醇脫水，利用松節油透明，采用中性樹膠封片。以磷酸鹽緩沖液代替一抗染色作為陰性對照物，使用美國Santa Cruz公司提供的對照物作為陽性對照。Ki-67染色若細胞膜或細胞質中出現棕黃色顆粒沉著則可判定為陽性細胞。上述操作中鼠抗人Ki-67單克隆抗體為克隆號MIB-1，檢測全套超敏染色劑試劑盒與二氨基聯苯胺顯色劑均產自美國Maxim Biotech公司；顯色劑、緩沖液、檸檬酸鈉鹽均由北京中杉金橋公司提供。三種蛋白染色方法基本一致。

1.3.3判別準則 經400倍顯微鏡可觀察到切片的總體，判別陽性的規范均依據有無染色、染色程度及顯色細胞數量聯合進行：(+)：細胞顯色百分比為1%～30%，呈淡黃色；()：細胞顯色百分比為31%～60%，中等陽性反應，呈黃色；()：細胞顯色百分比>60%，呈棕黃色。

1.3.4隨訪 隨訪形式為入院復查或門診，隨訪內容包括影像學檢查、體格檢查等，除此外還應開展電話隨訪，全部患者中無失訪者，最長隨訪時間為36個月。

1.4統計學方法 應用SPSS20.0統計學軟件處理單因素采用Kaplan-Meier法檢驗，多因素采用Cox回歸分析檢驗。

2 結 果

2.1治療與隨訪 50例老年宮頸癌患者全部手術成功，術后9例(18.00%)患者接受放療，7例(14.00%)患者術后接受化療；對于存在切緣陽性、盆腔淋巴結陽性、宮旁組織陽性者，均于術后給予盆腔放療與含順鉑的化療。50例患者中有18例(36.00%)接受放化療，化療方案為：分3 d靜滴的75 mg/m2順鉑聯合4 d微量泵泵入的1g/(m2·24 h)5-氟尿嘧啶。全部患者接受36個月的隨訪，其中位隨訪時間為19.5個月。

2.2免疫組化結果 Ki-67蛋白強陽性表達占比最高，其次為中等陽性、弱陽性，p16蛋白經檢測有23例呈陰性，其余陽性者以弱陽性表達為主，其次為中等陽性、強陽性；EGFR蛋白陰性表達5例，其余陽性者以強陽性表達為主，其次為弱陽性、中等陽性，見表1，圖1～3。

表1 50例老年宮頸癌患者免疫組化結果〔n(%)〕

圖1 Ki-67免疫組化染色不同表達情況(DAB,×400)

圖2 p16在宮頸癌中陽性表達(DAB,×400)

圖3 EGFR在宮頸癌中的陽性表達(DAB，×400)

2.3Ki-67、p16、EGFR表達與老年宮頸癌手術患者預后的相關性 經Kaplan-Meier單因素生存分析發現，Ki-67、p16、EGFR蛋白與老年宮頸癌手術患者預后相關，后經Cox比例風險函數檢驗發現，Ki-67、p16、EGFR蛋白陽性表達復發相對危險度是Ki-67、p16、EGFR陰性表達的4.474、3.055、2.958倍，提示Ki-67、p16、EGFR對老年宮頸癌手術患者無進展生存期有影響，可作為老年宮頸癌手術患者預后獨立影響因素(P<0.05)。見圖4～6，表2。

圖4 老年宮頸癌術后患者Ki-67不同表達的生存曲線

圖5 老年宮頸癌術后患者p16不同表達的生存曲線

圖6 老年宮頸癌術后患者EGFR不同表達的生存曲線

表2 Ki-67、p16、EGFR陽性表達對老年宮頸癌預后影響Cox回歸分析結果

3 討 論

宮頸癌起病前期患者無明顯癥狀，與慢性宮頸炎極為相似，部分患者可見子宮頸潤滑，尤其是老年患者常伴子宮頸萎縮，以陰道出血、陰道分泌物增加、分泌物血腥或白色或黏稠、分泌物惡臭等為主要癥狀表現〔9〕。早期疾病得不到重視，錯過最佳治療機會將發展至進展期，進展期宮頸癌常有病變侵犯繼發性癥狀，如便秘、肛門腫脹、閉塞、下肢疼痛、下肢腫脹等，更甚者可導致輸尿管梗阻等并發癥，危及生命〔10〕。

Ki-67蛋白是增殖細胞核抗原，該蛋白位于染色體10，包含2個變體，11.5與12.5 kb共同組成了該基因全長，在維持細胞增殖活性過程中有著關鍵作用〔11〕。在有絲分裂階段S、G1、G2、M期Ki-67抗原將分解，因該抗原具有半衰期短的特點，其并不存在于G0期，故能夠直接準確地反映出細胞增殖活性情況，且應用明顯優于DNA指數、PCNA指數及DNA倍數等諸多其他可反映細胞增殖的指標〔12〕。一直以來，臨床實際應用中，常以細胞核染色陽性對Ki-67進行判別，該蛋白檢測后陽性表達越高，則提示惡性腫瘤患者分級程度越高，預后越差〔13〕。目前，Ki-67蛋白被廣泛用于非腫瘤與腫瘤的細胞增殖活性評估中，且與卵巢癌、乳腺癌、腦膠質瘤等諸多腫瘤生物學行為息息相關，如當Ki-67蛋白表達<5%時，胃腸道間質瘤患者的PTEN基因點突變數可超過50%，患者死亡風險高〔14〕。本研究結果顯示，50例老年宮頸癌手術患者Ki-67蛋白無陰性表達，且以強陽性表達占比最高，其次為中等陽性、弱陽性，經生存函數分析后發現，Ki-67蛋白高表達患者死亡風險高，預后差，該結果與多數研究基本一致〔15，16〕，提示Ki-67蛋白可用于老年宮頸癌手術患者預后的評估，其高表達可能是患者不良預后的獨立影響因素。

p16基因被稱為多腫瘤抑制基因INR4I、MTS1或CDRN2，其編碼的p16蛋白是細胞周期素依賴性激酶阻止物，可以負調控Rb基因所控制的細胞增殖周期，普遍用于惡性腫瘤療效評估與預后分析〔17〕。隨著臨床對宮頸癌研究的深入，相關研究指出宮頸癌患者HPV感染可能會增加患者p16表達〔18〕，楊然等〔19〕研究了宮頸癌手術治療患者p16蛋白表達與術后生存期的關系發現，p16蛋白并不能作為患者獨立的預后因素，且在生存分析中無意義；而本研究結果顯示，經Kaplan-Meier單因素分析p16蛋白有統計學意義，與上述結果有差異，這可能是因為本研究中所選患者均為年齡≥60歲的老年患者，患者年齡大，身體素質差，預后不佳，故p16蛋白對其預后的預測更為敏感。但因本研究與其他類似研究還有一定差異，故尚不能將p16完全作為宮頸癌患者預后的獨立因素，還應在后續的研究中進一步證實。

EGFR是一種原癌基因表達產物，參與腫瘤的發生發展過程，該蛋白在放療抵抗的RTK-PI3K/AKt獲得性途徑中起到關鍵作用。EGFR的表達與諸多因素有關，Giordano等〔20〕研究表明，老年宮頸癌患者的EGFR陽性率(91%)是青年患者的1.18倍，而在本研究中，50例老年宮頸癌手術患者的EGFR陽性率為90%，與該報道結果基本一致，可見年齡對宮頸癌患者EGFR蛋白的影響。而研究了EGFR與患者預后的相關性后發現，隨著時間的延長，EGFR陽性表達患者的生存優勢不及陰性表達者，且經Kaplan-Merier生存曲線與Cox生存回歸分析檢查均有意義，表明EGFR蛋白與老年宮頸癌手術患者預后有一定相關性，隨著該蛋白陽性表達增加，患者死亡風險提高，無進展期生存時間縮短。但因EGFR蛋白在宮頸癌患者中的表達仍存在一定陰性率，故尚不能將其作為患者獨立的預后因素，僅能夠認為其與患者預后相關。

綜上所述，Ki-67、p16、EGFR蛋白表達均與老年宮頸癌手術患者預后有一定相關性，其中Ki-67、EGFR蛋白的高表達可能預示著高死亡風險，可作為預后獨立因素，而p16蛋白因其陽性情況相對較弱，可能僅與預后相關，尚不能作為預后獨立因素。