藍光對老年小鼠角膜上皮組織和淚膜功能的影響

袁晴 李娟 劉康成 葉蕾 李清海 劉鈺鑫 閔幼蘭 邵毅

(1南昌大學第一附屬醫院眼科，江西 南昌 330006；2西安市第四醫院眼科)

研究證明發光二極管(LED)會對眼部造成損傷〔1〕，包括眼表和眼底的各個組成部分，雖然可采取一定的保護措施，但仍不能完全避免其帶來的損傷〔2〕。藍光屬于LED構成元素中的一種，波長380～500 nm，用于治療新生兒黃疸〔3〕，但藍光對眼睛有害。本文旨在探討藍光對老年小鼠的淚膜和上皮細胞的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選取24只BABL/c老年雄性小鼠(體重20～25 g，24～28周齡，西安交通大學醫學院實驗動物中心提供)，均為無特定病原體(SPF)級，實驗前先在裂隙燈顯微鏡下觀察有無角膜異常，整個實驗過程均在標準環境下飼養〔4〕。將24只老年小鼠隨機分為兩組，A組不進行任何處理，B組持續照射藍光，分別于干預前、干預后1、4、7 d行淚液分泌測試(SIT)、淚膜破裂時間(BUT)檢測，實驗第7天行角膜熒光素染色(FL)，取所有小鼠眼球做透射電鏡及切片蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察角膜上皮損傷情況。本次研究實驗符合動物倫理委員會要求〔5〕。

1.2藍光籠制作 鼠籠頂部安置兩根藍光燈管(波峰430 nm，半波寬約20 nm，藍光強度2.635 mW/cm2)，留出喂食通道，鼠籠四周貼上反光的鏡面紙，為防止燈管產熱對實驗造成誤差，裝置排風扇，底面放置墊料。

1.3SIT 首先將淚液檢查酚紅棉線(天津晶明新技術開發有限公司)剪成1.5 cm長，剪棉線時注意保證邊緣整齊，以免因粗糙刺激角膜而影響實驗數據。左手抓穩老年小鼠并固定頭部，使其眼瞼處于自然狀態，右手持鑷子夾住棉線一端，將另一端置于小鼠內眥處并保持姿勢固定，15 s后取出棉線拉直，用游標卡尺讀出棉線浸濕的長度并記錄。保證由同一操作者在相同環境(溫度、濕度、時間、光照強度)下完成測試。

1.4BUT 參照文獻的方法〔6〕，將1 μl 10 g/L的熒光素鈉用移液槍滴入老年小鼠眼表，并輔助其瞬目，此刻的熒光素鈉已經很好地附著在眼表，然后在裂隙燈顯微鏡的鈷藍光下觀察并記錄小鼠角膜染色區出現第一個黑斑的時間，即為淚膜破裂時間，注意移液槍的槍頭不要觸及小鼠眼表，以免造成不必要的損傷而影響實驗結果。

1.5FL 給小鼠滴1滴1%熒光素鈉滴眼液，輔助其瞬目，評分系統參考文獻標準〔7〕，無任何染色為0分，輕微散點狀著染<30個點為1分，點狀染色≥30點，但未發生融合為2分；浸潤彌漫性染色，沒有斑塊為3分；有熒光素斑塊為4分。

1.6角膜HE染色 將老年小鼠的角膜制成冰凍切片，晾干，于冰丙酮中固定后沖洗，進行HE染色3 min，著色后沖洗，放入1%鹽酸酒精中分化并沖洗，伊紅染色，漂洗，分別在70%、80%、98%、100%酒精中脫水，二甲苯透明2次，晾干，樹膠封片。在顯微鏡下觀察老年小鼠角膜上皮細胞的情況。

1.7透射電子顯微鏡(TEM) 收獲角膜標本并在2.5%戊二醛和4%多聚甲醛的PBS溶液(pH=7.4)中固定2 h。將角膜標本包埋、切片和染色后用TEM顯微鏡(JEM2100HC，JEOL，Tokyo，Japan)拍攝TEM圖像。

1.8統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗、重復測量方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1SIT結果 干預前兩組SIT差異無統計學意義(P>0.05)。實驗第1天，與干預前相比兩組SIT差異無統計學意義(P>0.05)，兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。干預后4、7 d，A組與實驗前相比SIT差異無統計學意義(P>0.05)，B組與實驗前相比SIT顯著降低(P<0.05)，且B組SIT明顯小于A組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組干預前后SIT比較

與干預前比較：1)P<0.05；下表同

2.2BUT結果 干預前，兩組BUT差異無統計學意義(P>0.05)；干預后1 d，兩組與實驗前相比BUT差異無統計學意義(P>0.05)，兩組間BUT差異無統計學意義(P>0.05)；干預后4、7 d，與實驗前相比，B組BUT明顯降低(P<0.05)，且B組BUT明顯小于A組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組干預前后BUT比較

2.3FL結果 干預前，兩組FL評分差異無統計學意義(P>0.05)；干預后1 d，兩組與實驗前相比FL評分差異無統計學意義(P>0.05)，且兩組間FL評分差異無統計學意義(P>0.05)；干預后4、7 d，A組與實驗前相比，FL評分差異無統計學意義(P>0.05)，而B組出現大量斑塊著染，差異有統計學意義(P<0.05)，且B組FL評分明顯大于A組(P<0.05)，見表3。

2.4HE染色結果 A組角膜上皮由4～6層上皮細胞組成，細胞排列整齊緊密，無缺損；B組角膜上皮層數未見明顯增加，基底細胞層為單層柱狀上皮，角膜厚度未發生明顯改變，表層上皮未見脫落、損傷，表面光滑(圖1)。兩組上皮細胞層數差異無統計學意義(P> 0.05)；A組上皮空泡細胞數顯著大于B組(P<0.05)，見表4。

表3 兩組干預前后各時段角膜FL評分分,n=24)

圖1 兩組角膜HE染色(×400)

表4 兩組干預后角膜HE染色及電鏡結果對比

2.5TEM結果 A組上皮細胞界限分明，明亮細胞較多，微絨毛和褶皺排列整齊，未見明顯異常；B組上皮細胞形態未見異常，大小均勻等，邊界較清晰，微絨毛和褶皺排列整齊，微絨毛數量減少，但與A組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表4、圖2。

圖2 兩組角膜TEM圖像(×10 000)

3 討 論

LED因其低耗能、照明強而在市場上占據越來越大的地位，而對眼睛造成的損傷不容忽視〔8〕，會導致近視、白內障等眼部疾病〔9〕。同時也有研究表明強光、激光照射會促進脈絡膜新生血管形成，損傷視網膜結構與功能〔10～12〕。LED包含紅、藍、綠3種不同波長的光，其中藍光波長介于380～500 nm之間，而角膜僅能吸收295 nm以下的可見光〔13〕，故藍光可能會對角膜造成損傷。大氣中的紫外線為不可見光，波長小于400 nm，當眼球過度吸收紫外線時，發現患白內障的概率大大增加〔14〕。當然，并不是所有的藍光都對人體有害，藍光中存在低能量部分是可以起到保護作用的〔15〕，可以刺激黑色素細胞而調節人體的晝夜規律〔16〕，但藍光中的高能部分(波長415～455 nm)同紫外線一樣，會對眼球造成損傷，致使視網膜細胞凋亡，發生黃斑變性等〔17～20〕，而這些高能藍光主要存在于電子產品中，如智能手機、平板電腦等。氧化應激反應和細胞凋亡在干眼癥發病中起關鍵作用〔21〕，而藍光具有促進氧化應激的作用〔22〕。研究表明，過度暴露于具有短波長的藍光下可引起角膜氧化，增加角膜及淚膜中炎癥因子的表達，如白細胞介素(IL)-1β，IL-6，通過核因子(NF)-κB和絲裂原活化蛋白激酶信號通路，形成氧化應激產物，導致角膜上皮細胞DNA損傷，從而導致上皮細胞凋亡、杯狀細胞減少及黏蛋白表達紊亂，繼而造成淚膜損傷導致干眼癥〔23〕。

本研究使用小鼠為研究對象是因為其眼表和人相似，角膜上皮細胞均由外胚層發育而來，將角膜分層，使之處于非角化狀態〔24〕。眼表的腺體分泌受中樞神經系統調控，當淚膜損傷，眼表的光滑度則變差，中樞神經系統的調控作用會隨之下降〔25〕，因此，保護淚膜的穩定性顯得尤為重要。淚膜從外到內分別為脂質層、水液層、黏蛋白層，厚度約3 μm，很容易發生損傷。淚膜的主要功能是維持眼表水分穩定〔26〕，對獲取清晰視力起到了不可或缺的作用，當眼表水分丟失時，淚膜功能受損，導致眼部出現的各種不適癥狀稱為干眼綜合征〔27〕。主要表現為眼部不適、異物感、視疲勞、視物模糊等癥狀〔28,29〕。因此，有效地保護淚膜對降低干眼癥的發病率起到了重要作用。導致干眼的因素有很多，如吸煙、維生素缺乏和性激素失調等〔30～32〕。本實驗可能時間較短，尚未累及到角膜上皮細胞，同時，沒有設置不同的光照梯度，分組較少，對比不夠強烈。當然，藍光的功率也需要進一步探索。因此認為，短期藍光照射會影響老年小鼠淚膜功能的穩定性，而對角膜上皮組織未造成損傷。本實驗顯示藍光對淚膜的穩定性產生影響，而干預后7 d HE染色與正常對照組結果無明顯差異，透射電鏡未見明顯異常，推測可能實驗時間較短，尚未累及到角膜上皮細胞。

綜上，高能藍光照射會影響老年小鼠淚膜的穩定性。但由于本實驗藍光照射的時間較短，對角膜上皮的影響無法進行較好的觀察。而且研究并未對藍光的能量設置較好的梯度，也就無法判斷各個能量梯度的藍光對淚膜的穩定性及角膜上皮的影響程度。今后可進一步加長藍光照射的時間及設置不同的照射強度。另外，藍光損傷眼表與結膜杯狀細胞的黏蛋白分泌、眼瞼腺體(如瞼板腺和淚腺)形態變化而導致的淚膜黏蛋白層和脂質層成分改變等是否有一定的關聯也需進一步研究。值得探究的是，藍光照射是否是一個可逆的過程，去除藍光暴露的條件，老年小鼠的淚膜是否可以有所恢復甚至恢復正常，有待進一步研究。