瞿麥對腎癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的調控

董建設 趙俊峰 張林超 陳瑞廷 賈占奎 楊錦建

(1河南省中醫院泌尿外科，河南 鄭州 450000；2鄭州大學第一附屬醫院泌尿外科)

腎細胞癌(RCC)又稱腎癌，是常見的泌尿系統惡性腫瘤之一，起源于腎實質，多發生于中老年人，男性患者多于女性。近年來腎癌患病率呈現出明顯的上升趨勢〔1〕。腎癌治療方式以手術切除輔以放化療的綜合治療方式為主，但放化療對患者產生較大的副作用，且患者易產生放射不敏感性及耐藥性，大大影響后期放化療效果〔2,3〕。因此，尋找新的治療方式對于改善腎癌的治療現狀顯得尤為重要。近年來采用中藥輔助治療腫瘤的研究成為國內外學者的研究熱點〔4〕。瞿麥是石竹屬植物，是傳統的中藥材，具有破骨涌經、清熱、利尿的功效。研究表明，瞿麥具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化免疫調節等多種藥理作用〔5,6〕。從瞿麥中分離出的環肽化合物對肝癌、乳腺癌、肺癌具有較好的抗腫瘤作用〔7〕；從瞿麥中分離的黃酮類化合物可通過細胞內線粒體凋亡途徑誘導人體表皮細胞癌細胞的凋亡〔8〕，還可抑制人子宮內膜癌細胞增殖〔9〕。本實驗通過瞿麥干預腎人癌細胞，對細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響進行研究，并對其作用機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1材料 人腎癌細胞786-0購于中國科學院上海生命科學院細胞庫；瞿麥根提取物購于蘭州沃特萊斯生物科技有限公司，純度為99%；胎牛血清、RPMI1640培養基、胰蛋白酶、MTT購于美國Sigma公司；青霉素、鏈霉素購于杭州四季青生物工程材料有限公司；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR檢測試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；膜聯蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒購于江蘇凱基生物科技股份有限公司；實驗所用引物由上海生工生物工程技術股份有限公司合成；BCA蛋白定量試劑盒、電化學發光(ECL)底物購于上海炎熙生物科技有限公司；鈣黏附蛋白E(E-cadherin)單抗、神經性鈣黏附素(N-cadherin)單抗和波形蛋白(Vimentin)單抗均購于美國Epitomics公司。

1.2腎癌細胞培養 人腎癌細胞786-0培養用含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基，培養條件為體積分數5%的CO2、飽和濕度、37℃恒溫細胞培養箱，取處于對數生長期的腎癌細胞進行實驗。

1.3MTT檢測腎癌細胞增殖能力 取對數生長期的腎癌細胞接種于96孔細胞培養板中，接種密度為3×103個/孔，繼續培養待細胞貼壁生長后，去除原培養基，添加含不同濃度的瞿麥根提取液的培養液，各組對應濃度分別為0.0 μg/ml、12.5 μg/ml、25.0 μg/ml、50.0 μg/ml、100.0 μg/ml，每組設置5個平行復孔。在加入含瞿麥的培養基后24、48 h時，分別在細胞培養孔中加入0.5 mg/ml的MTT溶液200 μl，置于37℃條件下繼續孵育4 h。吸取上清后，再在每孔中加入二甲基亞砜 100 μl，緩慢搖動孵育10 min。使用酶標儀測定各組細胞在450 nm波長處的吸光度值(A值)。計算各組細胞增殖抑制率。以0.0 μg/ml組測得的A值為對照計算百分比，抑制率=1-(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.4流式細胞術檢測腎癌細胞凋亡率 選取對數生長期的腎癌細胞，將細胞隨機分為3組，分別為對照組(0 μg/ml組)、藥物組(分別給予50 μg/ml、100 μg/ml濃度的瞿麥處理腎癌細胞)。待細胞處理48 h后，用胰蛋白酶消化各組細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，用結合緩沖液重懸細胞制成單細胞懸液，調整各組細胞量約為1×105個，加入Annexin V-FITC 5 μl混勻后，再加入PI 5 μl，于室溫下反應15 min后，采用流式細胞儀測定各組腎癌細胞凋亡率。

1.5qRT-PCR檢測腎癌細胞中Bax和Bcl-2表達水平 各組腎癌細胞分別培養48 h以后，按照Trizol提取RNA試劑盒提取各組腎癌細胞總RNA，提取的RNA經濃度和純度檢測，A260/A280值為1.98，保證了RNA提取的完整性，可用于后續實驗。采用碧波逆轉錄酶(M-MLV)反轉錄試劑盒合成cDNA，用實時熒光定量PCR檢測試劑盒進行熒光定量PCR，采用20 μl反應體系〔SYBR Green 10 μl，cDNA模板4 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，焦碳酸二乙酯(DEPC)-H2O 4 μl〕，反應為40個循環。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為參照，用相對定量2-△△CT分析Bax和Bcl-2的表達水平。

1.6劃痕實驗檢測腎癌細胞遷移能力 用記號筆在細胞培養板底部均勻劃數條橫線，保證所劃橫線穿過細胞培養孔。將各組處于生長對數期的腎癌細胞接種于6孔培養板中，以無血清培養基饑餓處理12 h，用滅菌過的100 μl移液槍槍頭垂直于橫線劃出均勻的細胞劃痕，用PBS洗滌劃下的細胞及細胞碎片，加入含10%血清的培養液，加入相應濃度的瞿麥(終濃度為50 μg/ml和100 μg/ml)，于劃痕48 h后，在劃痕處拍照記錄細胞遷移結果。

1.7Transwell實驗檢測腎癌細胞侵襲能力 在Transwell小室的聚碳酸酯膜上加入稀釋過的基質膠60 μl，置超凈工作臺中使基質膠過夜聚合重建基膜。取對數生長期的腎癌細胞以PBS洗滌3次，用不含血清的培養液重懸細胞制成細胞懸液，調整細胞密度為5×104/L，在Transwell上室加入細胞懸液100 μl，各組細胞中加入不同濃度的瞿麥至終濃度為0、50、100 μg/ml，在下室加入含10%血清的培養液500 μl，置于37℃培養箱中培養48 h。棄去培養液取出小室，用棉簽拭去上室的細胞，用40 ml/L的多聚甲醛固定10 min，用1 ml/L的結晶紫染色15 min，在倒置顯微鏡下計數穿膜細胞個數，以穿膜細胞數表示細胞的侵襲能力。

1.8Western印跡檢測腎癌細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達水平 處于對數生長期的腎癌細胞分別加入濃度為0、50、100 μg/ml的瞿麥，培養48 h后，去除培養液后用PBS洗滌細胞3次，每孔細胞中加入苯甲基磺酰氟(PMSF)裂解液150 μl，置冰上裂解30 min。用細胞刮把細胞刮落收集至EP管內，10 715 r/min離心10 min收集上清。用BCA法對蛋白進行定量測定。每個泳道孔加入50 μg變性的蛋白樣品，以5%的濃縮膠、12%的分離膠電泳分離蛋白，以半干法轉膜，轉膜條件為80 V電壓，4℃轉膜120 min。以5%脫脂奶粉在搖床上室溫封閉60 min。分別加入E-cadherin(1∶800稀釋)、N-cadherin(1∶800稀釋)和Vimentin(1∶500稀釋)的一抗在4℃中過夜反應，用PBS洗滌后，加入二抗在室溫中繼續孵育2 h。采用ECL化學發光，成像系統中掃描圖像，以每組腎癌細胞中GAPDH灰度值為參照，分析各組腎癌細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白表達水平。

1.9統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1瞿麥對腎癌細胞增殖抑制的影響 隨著瞿麥濃度的升高，腎癌細胞增殖抑制率也明顯升高，呈現出一定的濃度依賴性，差異具有統計學意義(P<0.05)。當瞿麥濃度到達100 μg/ml時，對腎癌細胞抑制率最高。隨著瞿麥作用時間的延長，50 μg/ml和100 μg/ml組腎癌細胞增殖抑制率明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2瞿麥對腎癌細胞凋亡的影響 0、50、100 μg/ml組腎癌細胞凋亡率分別為(4.52±0.51)%、(26.48±3.16)%、(57.97±6.06)%，隨著瞿麥濃度的升高，腎癌細胞凋亡率也顯著升高，呈現出一定的濃度依賴性，與0 μg/ml組相比，50、100 μg/ml組細胞凋亡率顯著升高，與50 μg/ml組相比，100 μg/ml組細胞凋亡率顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.3瞿麥對腎癌細胞中Bax和Bcl-2表達的影響 50、100 μg/ml組腎癌細胞中Bax、Bcl-2 mRNA表達，與0 μg/ml組相比差異具有統計學意義(P<0.05)；50 μg/ml與100 μg/ml組比較，Bax、Bcl-2 mRNA差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 不同濃度瞿麥對腎癌細胞的增殖抑制率比較

與0 μg/ml組比較：1)P<0.05；與12.5 μg/ml組比較，2)P<0.05；與25 μg/ml組比，3)P<0.05；與50 μg/ml組比，4)P<0.05；與同濃度24 h比較：5)P<0.05

表2 不同濃度瞿麥對腎癌細胞中Bax和Bcl-2相對表達量的影響

與0 μg/ml組比較：1)P<0.05；與50 μg/ml組比較：2)P<0.05；表3、4同

2.4瞿麥對腎癌細胞侵襲和遷移能力的影響 與0 μg/ml組比較，50、100 μg/ml組遷移距離及穿膜細胞數均顯著減少(P<0.05)；與50 μg/ml組比較，100 μg/ml組遷移距離及穿膜細胞數均顯著減少(P<0.05)。見表3。

表3 不同濃度瞿麥對腎癌細胞侵襲和遷移的能力的影響

2.5瞿麥對腎癌細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達水平的影響 與0 μg/ml組比較，50、100 μg/ml組顯著抑制N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平，上調E-cadherin蛋白的表達，隨著瞿麥濃度的增加，N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平逐漸降低，E-cadherin蛋白表達水平逐漸升高，組間E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表4。

表4 不同濃度瞿麥對腎癌細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平的影響

3 討 論

腎癌是常見的泌尿系統的惡性腫瘤之一，流行病學表明腎癌的發病相關的因素可能有遺傳、肥胖、吸煙及高血壓等有關，引發腎癌發生的具體分子機制目前還不十分明確〔10〕。目前治療腎癌的手段主要有手術治療、放療和化療，放療和化療毒副作用較大，而中藥不僅具有抗癌作用，毒性和不良反應少，還可減輕患者放療和化療后的一些不良反應，因此，中藥受到越來越多的研究者關注〔11,12〕。研究表明，從瞿麥中分離的多種活性物質可發揮抗癌作用〔13〕。從瞿麥中分離的水楊酰胺衍生物可通過抑制表皮生長因子受體激酶的激活，起到對人肝癌細胞HepG2增殖抑制的作用〔14〕。對瞿麥根部位采用石油醚萃取，提取的瞿麥活性物質處理人食道癌細胞，發現食道癌細胞增殖抑制率明顯升高，說明瞿麥可抑制人食道癌細胞增殖〔15〕。體外培養胃癌細胞BGC-823，用瞿麥分離物槲皮素作用于胃癌細胞，碘化吡啶染色結果顯示，胃癌細胞發生凋亡〔16〕。本實驗結果顯示瞿麥處理后腎癌細胞增殖受到抑制，凋亡率升高，說明瞿麥可抑制腎癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，與上述研究類似。

細胞凋亡是由凋亡相關基因所調控的細胞自主的有序的死亡，目前研究較多凋亡相關的基因是Bax和Bcl-2〔17〕。Bax是一類促凋亡的基因，可促進細胞色素C的釋放，參與細胞中鈣離子濃度的調節，當Bax表達量增多往往導致細胞凋亡〔18〕。Bcl-2是一種抗凋亡基因，通常與Bax形成二聚體，當Bcl-2的表達減少時，Bax /Bcl-2比值升高，可誘導細胞凋亡〔19〕。對瞿麥有效活性物質提取后處理人胃癌細胞，采用流式細胞儀和Western印跡檢測細胞中半胱天冬酶以及Bax和Bcl-2基因表達量的測定，發現半胱天冬酶和Bax發生上調，Bcl-2發生下調〔20〕。本實驗對瞿麥處理的腎癌細胞中Bax和Bcl-2 mRNA的表達檢測結果顯示，Bax的表達顯著升高，Bcl-2的表達明顯降低，且細胞凋亡率升高，提示瞿麥誘導腎癌細胞凋亡與Bax和Bcl-2的表達有關。

上皮細胞-間充質轉化(EMT)是上皮細胞之間失去接觸聯系轉化為間充質細胞表型的一系列可逆的變化。通過EMT導致上皮細胞失去基底膜的連接，獲得較高的侵襲和遷移能力〔21〕。EMT在癌癥轉移、慢性炎癥及多種纖維化疾病中具有重要作用。上皮細胞特異性結合蛋白即細胞黏附分子E-cadherin蛋白表達減少，間充質細胞特性蛋白Vimentin、N-cadherin的表達增多，導致EMT的發生〔22〕。目前認為，EMT發生或減少的可靠的蛋白分子標志是Vimentin、N-cadherin和E-cadherin〔23〕。研究表明，IL-33刺激腎癌786-0細胞后可誘導細胞發生EMT，促進786-0細胞侵襲和遷移〔24〕。瞿麥等中藥用于治療膀胱癌可抑制癌細胞發生擴散〔25〕。本研究中，用瞿麥處理腎癌細胞，細胞中E-cadherin蛋白表達增加，Vimentin、N-cadherin蛋白表達減少，說明瞿麥抑制EMT的發生，對瞿麥干擾的腎癌細胞侵襲和轉移的能力進行檢測，發現細胞侵襲和轉移的能力都減弱。提示瞿麥是通過抑制EMT的發生抑制腎癌細胞侵襲和轉移的能力。

綜上，瞿麥可以抑制腎癌細胞增殖、侵襲和遷移能力，促進腎癌細胞凋亡，其作用機制與Bax、Bcl-2基因及E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白表達有關。為進一步研究瞿麥抗癌作用奠定基礎，可為腎癌的治療提供新的作用靶點。