超聲微泡靶向介導miR-206抑制宮頸癌生長

趙苗 趙云 劉朝奇 周軍 馬瑤 鄭智唯 姜矜君

(1三峽大學醫學院 腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443000；2武漢市第一醫院超聲科；3三峽大學第一臨床醫學院超聲科)

基因治療是近年來興起的一種新型的腫瘤治療方法，微小RNA(miRNA)在腫瘤的發生發展中起重要作用。miR-206參與了包括腫瘤在內的多種疾病〔1～6〕。研究證實，宮頸癌組織中miR-206表達下調，C-Met作為miR-206的靶基因，在宮頸癌組織中上調，C-Met的上調促進宮頸癌的發生發展，miR-206在宮頸癌中低表達影響宮頸癌患者的進展和預后〔7〕。因此，miR-206可能是宮頸癌的新型治療工具，然而目前尚無運用miR-206治療宮頸癌的相關報道。研究顯示超聲技術在介導基因輸送中有獨特的優勢，以微泡作為基因載體聯合超聲靶向破壞微泡技術(UTMD)可以有效介導基因轉染細胞從而抑制腫瘤細胞生長〔8～10〕。目前微泡介導基因治療多停留在細胞水平，而鮮有通過體內實驗證實基因治療效果的研究報道。本研究旨在通過體內實驗探討自制的載miR-206微泡對宮頸癌生長的影響，有望為宮頸癌治療提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1動物、試劑和設備 SPF級雌性純系BALB/c小鼠18只，體重18～22 g，由湖北三峽大學重點實驗室提供。宮頸癌U14細胞由三峽大學腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室提供。磷脂材料二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC，美國Avanti公司)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG 2000，美國Avanti公司)；N,N′-羰基二咪唑(CDI，中國阿拉丁公司)、硬脂酸(Stearic，中國阿拉丁公司)；支鏈聚醚酰亞胺-600(PEI-600，中國阿拉丁公司)；全氟丙烷(C3F8)；DiO(美國Sigma)?；蜣D染治療儀UGT1025(重慶醫科大學超聲影像研究所)，激光共聚焦顯微鏡(日本尼康公司)；掃描電鏡JSM-7500F(日本電子公司)；銀汞調和器；倒置熒光顯微鏡(日本尼康公司)；納米粒度電位分析儀(美國Marlven)；氣體交換裝置(自制)。

1.2miR-206真核表達質粒的構建 NCBI查獲miR-206的基因組序列，Primer 5設計PCR引物，通過 PCR擴增獲得miR-206前體，瓊脂糖凝膠電泳及DNA洗脫后，將PCR回收產物連接于卡那霉素抗性標記的真核表達載體pcDNA3.1上，最后將連接片段轉化至感受細胞Ep100，挑取單克隆，進行卡那霉素抗性篩選，通過酶切和測序進行鑒定。

1.3載基因微泡的制備及基本性質測定 按一定的比例分別將硬脂酸、CDI、PEI-600溶解于無水二氯甲烷，采用冷乙醚沉淀、離心純化和真空干燥制出硬脂酸-PEI600。將成膜材料DSPC、DSPE-PEG2000、PEI-600以摩爾比9∶0.5∶0.5混合溶解在三氯甲烷中，使用氮氣(N2)使磷脂在試管壁上形成均勻的白色薄膜，加入Tris緩沖溶液水化超聲至透明，用自制的氣體交換裝置將氣體置換成C3F8，銀汞調和器機械振蕩40 s后制得空微泡，以一定比例與質粒孵育制得載基因微泡。通過血細胞計數板計算微泡濃度，激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡觀察形態，粒徑分析儀檢測微泡粒徑。

1.4模型構建及實驗分組 體外培養宮頸癌U14細胞，于小鼠右前肢靠近背部處接種U14細胞。根據處理方式不同將建模成功的小鼠隨機分為3組(每組6只)：空白對照(control)組、空微泡+超聲(MB+US)組、載miR-206微泡+超聲(miR-206 MB+US)組。

1.5基因治療 當腫瘤結節直徑為1 cm左右時開始治療，將100 μg的質粒與0.2 ml的微泡(濃度為9×109/ml)室溫下孵育30 min，經尾靜脈注射到miR-206 MB+US組的每只小鼠體內，5 s內注射結束，同時對腫瘤結節區域進行超聲輻照，輻照條件：9檔，單路晶片輸出聲功率0.99 W，頻率為1.00 MHz，占空比50%，連續輻照60 s；MB+US組尾靜脈注射0.2 ml空微泡，并給予同等條件的超聲輻照；control組尾靜脈給予同樣體積的生理鹽水，不行超聲處理。每隔1天治療1次，共5次。

1.6治療效果評價 于每次治療前測量腫瘤大小并繪制腫瘤生長曲線，計算體積抑瘤率。最后一次治療24 h后頸椎脫臼法處死小鼠，剝取腫瘤并稱取瘤重，計算重量抑瘤率。4%多聚甲醛液中固定后石蠟包埋，5 μm切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察各組腫瘤組織病理情況。其余組織置于-80℃冰箱保存，用于行RT-PCR檢測各組宮頸癌組織中miR-206的含量，及行免疫組織化學檢測腫瘤組織中肝細胞生長因子受體(C-Met)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、雷帕霉素靶體蛋白(mTOR)的表達。擴增曲線呈標準S型，溶解曲線峰形尖銳，無雜峰，采用2-ΔΔCT法對數據進行分析，設control組各基因的表達量為1，計算各miR-206的相對表達倍數。

1.7統計學分析 應用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1微泡基本特性 自制的陽離子脂質微泡粒徑為(0.94±0.53)μm，濃度為0.9×109個/ml。激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡下觀察微泡呈球形，粒度分布均勻，分散性好，幾乎所有的微泡尺寸都在5 μm以內，符合臨床超聲造影劑對粒徑的基本要求，見圖1。

A:激光共聚焦顯微鏡白光圖(×1 000)；B：掃描電鏡圖(×5 000)；C:微泡粒徑分布圖圖1 微泡基本特性

2.2模型構建 18只實驗小鼠皮下注射7 d后接種部位出現米粒大的結節，各組小鼠的平均體重和平均小鼠腫瘤體積的組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組腫瘤體積及體重比較

2.3腫瘤生長情況 治療第3～11天，MB+US組及miR-206-MB+US組腫瘤大小均顯著小于control組，且miR-206-MB+US組顯著小于MB+US組(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。治療結束后MB+US 組和miR-206 MB+US組的體積抑瘤率分別為(45.63±2.59)%、(85.59±16.05)%，重量抑瘤率分別為(8.56±1.68)%、(74.71±1.81)%，兩組比較差異均有統計學意義(P<0.001)。見表2。

2.4miR-206檢測 miR-206 MB+US組中miR-206的相對含量最高(5.73±1.11)，與MB+US組比較差異有統計學意義(1.50±0.31，P<0.05)。

2.5腫瘤組織病理結果 control組和MB+US組腫瘤組織HE染色可見癌細胞排列緊密，紊亂，無極性，胞核增大且深染，胞質相對減少，miR-206 MB+US組可見片狀凝固性壞死，腫瘤新生微血管密度減少，損傷最嚴重，見圖2。

2.6免疫組化結果 C-Met、p-AKT、mTOR陽性表達的細胞胞質被染成棕黃色。見圖3。miR-206 MB+US組C-Met、p-Akt、mTOR表達均顯著低于MB+US組及control組(P<0.05，P<0.01)；MB+US組p-Akt表達顯著低于control組(P<0.05)。見表3。

表2 各組治療不同時間腫瘤生長情況

與control組相比:1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001;與MB+US組相比:4)P<0.01

箭頭所指為凝固壞死區域圖2 HE染色光鏡圖(×200)

表3 各組C-Met、p-Akt、mTOR表達比較

與control組相比:1)P<0.05，2)P<0.01;與MB+US組相比:3)P<0.05

3 討 論

miRNA是一種類似于siRNA的非編碼小分子片段，通過堿基配對與靶基因上的mRNA結合，誘導沉默復合體(RISC)抑制靶標基因翻譯或導致靶基因降解。miR-206可以通過跨膜受體蛋白Notch3、BAF53a、EGFR、血管內皮生長因子(VEGF)、間隙連接蛋白(Cx)43、細胞周期素(cyclin)D2、細胞分裂周期蛋白(Cdc)42、C-Met、細胞周期蛋白(CCN)D2抑制腫瘤的侵襲和轉移〔2～7〕。由此可見，miR-206在腫瘤防治研究中有很大的潛力，可通過多種不同的靶點和信號通路干預腫瘤細胞的增殖、分化、遷移、凋亡及腫瘤新生血管生成。迄今鮮有miR-206用于治療宮頸癌的研究報道。當微泡運輸基因時，利用超聲波和微泡造影劑之間的相互作用及其產生的空化效應和聲孔效應實現基因靶向轉染，從而達到靶向基因治療的目的〔5,8～10〕。

本實驗研究以與細胞膜相似的磷脂作為微泡外膜，是利用了其熔點低，在體溫條件下呈液態的特點，使脂質微泡在熱力學上具有穩定性和流動性，當微泡發生較大的形態變化時不會破裂，或者即使外膜出現裂口后也可以自動融合修復。自制微泡以低溶解性和低彌散性的C3F8作為填充氣體，加強了微泡的穩定性。通過在外膜材料中加入含有大量的親水基團表面活性材料PEI-600，可以避免微泡發生融合，進一步提高其穩定性，使其有充分時間運輸到靶區。粒徑分布圖和顯微鏡下圖顯示自制微泡粒徑均一，分布均勻，分散性好。微泡制備過程中加入PEI-600不僅提高了微泡穩定性，還可以通過改變表面電荷使負電荷基因鉆附在表面，保護基因不被血液中的核酸酶降解。體外孵育微泡與質粒，并經尾靜脈注射入體內，利用超聲對腫瘤結節區域進行局部輻照，促進miR-206轉染U14細胞。干預5次后，miR-206 MB+US組腫瘤生長明顯變緩，初步提示miR-206對宮頸癌的抑制作用，MB+US組對腫瘤體積及重量也有一定抑制，說明超聲聯合空微泡對宮頸癌生長也有一定抑制作用，可能是由于微泡發生破裂產生的能量改變血管壁和細胞膜的完整性及透通性進而損傷腫瘤細胞和腫瘤新生血管所致。各組HE染色結果提示miR-206可能參與宮頸癌細胞的增殖、凋亡和腫瘤新生血管生成。本實驗實時定量PCR結果證實超聲微泡成功介導miR-206轉染U14細胞。本實驗免疫組化結果提示C-Met、p-AKT、mTOR可能參與miR-206對宮頸癌細胞生長的調控，與既往研究結果一致〔11,12〕。

本研究自制的新型陽離子微泡具有攜帶和保護質粒的特性，作為一種新型的非病毒載體，微泡聯合UTMD能夠有效介導miR-206轉染宮頸癌細胞，抑制宮頸癌生長及腫瘤新生血管形成，其機制可能與C-Met作為miR-206的作用靶點，抑制或阻斷C-Met/p-AKT/mTOR信號通路有關，該技術有望成為宮頸癌治療的新方法，并為臨床失去手術治療機會的中晚期宮頸癌患者提供一種新的治療思路。本課題仍有一定的局限性，自制的微泡存在發生副作用的風險，包括變態反應和超敏反應，因此需要大量的動物實驗和人體試驗探究達到療效的最低劑量，并推出微泡造影劑的使用指南；本實驗樣本量少，有待于今后擴大樣本量進一步研究；miR-206抑制腫瘤生長可能受多基因調控，本實驗只探究miR-206其中一個靶基因C-Met，需要進一步深入探究其作用靶點及通路。因此，大樣本量的動物實驗驗證miR-206對宮頸癌的作用及作用通路是今后的一個研究方向。