活血益心方對大鼠缺血再灌注心肌損傷的保護作用

于艷波 劉占軍 蘆珊

(1吉林大學第二臨床醫院臨床技能培訓中心，吉林 長春 130062；2長春生物制品研究所有限責任公司；3吉林大學第二臨床醫院老年病科)

缺血性心臟病是人類最常見且危害嚴重的疾病之一，心肌缺血再灌注損傷是急性心肌梗死、冠心病等缺血性疾病常見的病理過程。目前臨床治療采用動脈搭橋、溶栓療法、冠脈介入等手段,可以使缺血心肌恢復血流供應,減少壞死和控制梗死面積進一步擴展。多數情況下，缺血后再灌注可修復損傷組織、臟器，恢復患者生命健康，但部分患者缺血心肌在恢復血液再灌注后，會誘發一系列的功能、結構、代謝及心肌細胞電生理特性等各個方面的損傷進一步加重的現象〔1〕，不僅不能恢復組織器官功能，反而加重臟器的結構損傷與功能障礙，即心肌缺血再灌注損傷。因此，保護缺血心肌、減少再灌注損傷顯得尤為重要?；钛嫘姆骄哂谢钛铕?、宣痹止痛的功效，本研究通過對大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的研究，進一步觀察其對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠，體重230～250 g，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，許可證號：SCXK-(吉)2016-0004。

1.2藥物與試劑 活血益心方,吉林中醫藥大學制劑室制備提供,批號：20160325；丹蔞片，吉林康乃爾藥業有限公司生產，批號：20160307；烏來糖，國藥集團化學試劑有限公司，批號：T20160310；丙二醛(MDA，批號：20161029)、超氧化物歧化酶(SOD，批號：20161026)、游離脂肪酸(FFA，批號：20161031)、一氧化氮(NO，20161011)測定試劑盒，均為南京建成生物工程研究所生產；天門冬氨酸氨基轉移酶(AST，批號：160961)、乳酸脫氫酶(LDH，批號：160430)、肌酸激酶(CK，批號：160901)測定試劑盒，均為中生北控生物科技股份有限公司生產；谷光甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、三磷酸腺苷酶(ATP，包括Ca2+-Mg2+-ATP、 Na+-K+-ATP)、C反應蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、內皮素(ET)、白細胞介素(IL)-1、IL-6測定試劑盒，批號：E20160901A，均為美國RB公司產品。

1.3儀器 PowerLab/8sp型多導生理記錄儀，澳大利亞；HX-100E型小動物呼吸機，成都泰盟科技有限公司生產；GF-D800型半自動生化分析儀，山東高密彩虹分析儀器有限公司生產；ST-360型酶標儀，上?？迫A實驗系統有限公司生產。

1.4方法

1.4.1分組及給藥 雄性Wistar大鼠60只(每組10只)，按體重隨機分為正常對照組，模型組，丹蔞片組(964 mg/kg)，活血益心方高(12.0 g生藥/kg)、中(6.0 g生藥/kg)和低劑量(3.0 g生藥/kg)組。每天分別灌胃給藥1次，對照組和模型組灌胃給予相同體積的蒸餾水，各組動物灌胃容積均為10 ml/kg，連續給藥10 d。

1.4.2模型制備 末次給藥(給藥第10天)1 h后，腹腔注射(ip)以生理鹽水配制的1.2 g/kg、10 ml/kg烏來糖溶液將動物麻醉，剝離氣管，連接小動物呼吸機，并于左側第3、4根肋骨處開胸，待呼吸穩定后，用拉鉤將肋骨拉開，暴露心臟，用4號手術線結扎左冠狀動脈前降支(左心耳下1 mm處)，后迅速將心臟輕推回胸腔，在結扎時結扎扣底墊1 cm長硅膠管(輸液器前段硅膠管1 cm)，結扎30 min后剪開結扎點〔2〕，進行再灌注，觀察120 min。記錄正常、開胸后、結扎后、再灌注120 min心電圖；空白對照組只穿線不結扎。

1.4.3觀察指標 試驗結束腹主動脈采血，離心分離血清，檢測血清CK、LDH、AST、MDA、SOD、GSH-PX、FFA、NO、ET、IL-1、IL-6、TNF-α、CRP活性或含量；取心肌，檢測Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP含量。同時每只動物取心臟同一部位，以10%甲醛固定，HE染色，做病理組織學檢查。

1.5統計學方法 采用SPSS22.0軟件行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1對缺血再灌注損傷模型大鼠血中心肌酶的影響 與對照組相比，模型組血中心肌酶活性異常增高(P<0.01，P<0.001)，而活血益心方高劑量組能明顯降低CK、LDH、AST酶活性(P<0.05)；丹蔞片可明顯降低CK、LDH酶活性(P<0.05)。見表1。

2.2對缺血再灌注損傷模型大鼠血中自由基的影響 與對照組相比，模型組血中SOD、GSH-PX活性明顯降低、MDA含量異常增高(P<0.05，P<0.001)，而給予活血益心方和丹蔞片后，可明顯糾正這種異常變化?；钛嫘姆礁鲃┝拷M均能明顯增強SOD活性(P<0.01，P<0.001)；活血益心方高劑量組、丹蔞片組明顯降低MDA含量(均P<0.05)；活血益心方高劑量組、丹蔞片組能明顯增強GSH-PX活性(P<0.01，P<0.05)。見表1。

表1 活血益心方對缺血再灌注損傷模型大鼠血清CK、LDH、AST活性及自由基的影響

與對照組比較：1)P<0.01，2)P<0.001，3)P<0.05；與模型組比較：4)P<0.05,5)P<0.01,6)P<0.001，下表同

2.3對缺血再灌注損傷模型大鼠心肌及血中能量代謝的影響 與模型組比較，丹蔞片組、活血益心方高、中劑量組能明顯增強心肌Ca2+-Mg2+-ATP活力(P<0.001,P<0.01,P<0.05)，活血益心方高劑量組及丹蔞片組可明顯增強心肌Na+-K+-ATP活力(P<0.01，P<0.05)；活血益心方各劑量組可明顯降低血中FFA含量(均P<0.01)；丹蔞片組對血中FFA含量無明顯影響(P>0.05)。見表2。

表2 活血益心方對缺血再灌注損傷大鼠心肌Ca2+-Mg2+-ATP、Na+-K+-ATP活力及FFA含量的影響

2.4對缺血再灌注損傷模型大鼠血中血管影響因子的影響 與對照組相比，模型組血中ET含量明顯升高(P<0.01)，NO含量明顯降低(P<0.001)，而活血益心方中、高劑量組和丹蔞片組均能明顯降低血中ET含量(P<0.01、P<0.05)；活血益心方低、中、高劑量組和丹蔞片組均能明顯增加血中NO含量(P<0.01、P<0.05)。見表2。

2.5對缺血再灌注損傷模型大鼠血中炎癥因子的影響 與對照組相比，模型組血中炎癥因子發生異常改變(P<0.05、P<0.01)，而活血益心方高劑量組、丹蔞片組均能明顯降低血中炎性遞質IL-1含量(P<0.05，P<0.01)；活血益心方各劑量組和丹蔞片均能明顯降低血中CRP、IL-6、TNF-α含量(P<0.001，P<0.01，P<0.05)。見表3。

表3 活血益心方對缺血再灌注損傷模型大鼠血清CRP、IL-1、IL-6、TNF-α含量的影響

2.6對缺血再灌注損傷模型大鼠心肌病理的影響 通過病理組織形態學觀察，結果顯示模型組與對照組比較，可見心肌細胞變性，心肌纖維斷裂，心肌細胞間隙明顯增寬，炎細胞浸潤，而給予活血益心方及丹蔞片后，心肌細胞變性及炎細胞浸潤不同程度減輕，心肌損傷得到明顯改善。見圖1。

圖1 各組心肌組織病理觀察(HE，×400)

3 討 論

心肌缺血/再灌注損傷是急性心肌梗死、冠心病等缺血性疾病常見的病理過程，其機制與氧自由基的生成、細胞內鈣離子超載、炎癥因子釋放等因素有關〔3〕，嚴重威脅著人類的身心健康。心肌缺血后,心肌細胞從可逆性損傷到不可逆性損傷之間有一個演變過程,這與心肌缺血程度有關，在一定時間內,缺血心肌的損傷是可逆的。雖然早期、及時再灌注心臟是防止心肌組織缺血造成進一步損害的有效方法，但缺血組織恢復血流灌注時，往往導致再灌注區域心肌細胞及局部血管顯著的病理變化，而這些改變的共同作用可導致進一步的組織損傷。近年來中藥治療心肌缺血取得了一定的進展，其特點為療效高、毒副作用小，在臨床應用中起著重要作用?；钛嫘姆绞且灾嗅t臨床實踐為基礎研制出的中藥復方制劑，對痰瘀互阻所致的冠心病、心絞痛具有很好的療效。本研究采用缺血再灌注心肌損傷模型，觀察活血益心方對缺血再灌注心肌損傷的保護作用。

心肌缺血再灌注損傷的機制較復雜，可造成心臟形態及功能方面的改變，因此，可通過心電圖、組織學和生化酶學等多項指標的檢測進行綜合判定分析〔4〕。心肌酶的釋放量是心肌損害程度的一個主要標志，在一定程度上反映心肌病變程度。正常情況下心肌酶存在于心肌細胞的胞質中，在維持心肌正常生理功能方面發揮著重要作用，當心肌發生缺血、梗死或再灌損傷時，心肌受損導致心肌細胞損傷嚴重，甚至壞死、破裂，使細胞膜的通透性升高，大量的CK、LDH等被心肌細胞釋放到血中，使血液中的酶含量顯著升高，活性急劇增強，進而加重對心肌的損傷〔5,6〕。而活血益心方能明顯抑制再灌注損傷動物血清CK、AST及LDH活性，表明活血益心方對心肌缺血再灌注損傷具有明顯保護作用。

當發生心肌缺血再灌注時，不僅氧自由基生成增多，而且機體對自由基的清除能力減低，從而造成氧自由基大量蓄積，引起心肌組織的嚴重損傷。MDA是自由基與細胞膜上多不飽和脂肪酸反應生成的脂質過氧化物，可反映體內脂質過氧化情況，間接地反映自由基攻擊的嚴重程度,其含量高低反映了氧自由基在細胞內的生成水平及其對細胞的損傷程度；SOD是體內清除自由基的主要成分，其活力可反映機體清除氧自由基的能力；GSH-PX是機體的內源性抗氧化物酶，反映機體的抗氧化能力。因此可以通過MDA含量及SOD、GSH-PX活性變化評定心肌缺血的程度及藥物作用機制〔7〕，試驗結果表明，活血益心方可以明顯降低血清MDA含量，顯著升高血清SOD、GSH-PX酶活性，說明活血益心方可以通過降低血清MDA含量，增強SOD、GSH-PX活性，使自由基代謝紊亂情況得以糾正，從而維持機體氧化及抗氧化系統的動態平衡, 減少自由基的毒副作用, 進而降低對心肌的損傷來保護心肌。

研究表明，在心肌缺血再灌注過程中，炎癥因子貫穿于心肌損傷的全過程，隨著再灌注的進行，大量活化的中性粒細胞聚集在心肌微血管并浸潤到心肌組織中，通過釋放細胞炎性物質引起心肌損傷，IL-1、IL-6和TNF-α、CRP作為重要的炎癥細胞因子在缺血再灌注損傷中被廣泛地關注。心肌細胞在缺血再灌注的刺激下可合成和分泌大量 TNF-α，TNF-α能誘發炎癥反應誘導白細胞聚集，促進IL-1、IL-6等炎癥介質產生和釋放〔4，8，9〕；炎癥細胞含有CRP受體，感染和創傷等應激反應時，血清CRP含量迅速升高，CRP的大量產生并活化炎癥細胞，進而誘導炎性反應發生，通過直接(浸潤、聚集)或間接(產生細胞因子)作用，引起血管內皮受損，使炎癥反應進一步增強，促進了心肌缺血再灌注損傷〔10〕。本研究表明，活血益心方可以抑制心肌缺血再灌注時炎性遞質激活，從而保護心肌缺血再灌注損傷。

NO是血管內皮細胞分泌的最重要的舒血管因子，具有舒張血管、抑制血小板凝聚、減輕炎癥反應等保護血管內皮細胞的作用〔11〕。ET是一種血管活性肽，具有強烈、持久的縮血管作用和促神經內分泌的作用。正常情況下，ET和NO處于動態平衡之中，對血管彈性進行動態調節，維持冠狀動脈各分支血管的舒縮功能。再灌注損傷時，血管內皮細胞受損導致內源性NO合成減少,使NO功能降低失活，NO和ET間平衡失調，導致血管舒縮功能紊亂及通透性改變，加劇心肌損傷。因此，糾正NO、ET的失衡對缺血心肌組織的保護將起積極的作用?；钛嫘姆侥苊黠@升高心肌再灌注損傷大鼠血清NO含量，顯著降低ET含量，表明活血益心方具有調節血管活性物質NO、ET的分泌的功能，從而達到拮抗心肌缺血再灌注損傷、對心肌損傷起到保護作用。

心肌缺血后再灌注易導致心肌發生嚴重的功能紊亂，其中鈣超載是重要的機制之一。ATP酶在心肌維持生理功能中發揮著極其重要的作用, 是心肌細胞活動的物質基礎。心肌缺血再灌注發生時,心肌細胞內能量代謝出現障礙，ATP合成量明顯下降，ATP酶(包括Ca2+-Mg2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP 酶等)活性隨之下降〔6〕，這兩種酶活性發生改變，必將引起胞質內Ca2+水平失調，從而產生各種病理變化，進一步導致心肌細胞鈣超載和能量代謝障礙?；钛嫘姆娇捎行У卮龠MNa+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性的恢復，抑制細胞內Ca2+超載，從而降低缺血再灌注損傷的程度。

心肌梗死時，FFA水平增高，隨著心肌利用脂肪酸供能增加，脂質中間代謝產物大量堆積，過多活性氧產生，損害線粒體，從而引起心臟收縮、舒張功能異常，增加心肌耗氧量，而加重心肌缺血，擴大缺血或梗死范圍，加重心肌的缺血損傷壞死,促進心律失常發生，甚至猝死〔12〕。本實驗結果表明，心肌缺血再灌后，FFA水平急劇升高，而活血益心方可明顯抑制FFA水平升高，從而保護心肌。綜上所述，活血益心方能有效減輕心肌病變程度，改善心肌酶活性和能量代謝，對抗自由基損傷，激活血管活性物質，抑制炎癥反應發生，保護和穩定心肌細胞，對缺血再灌注損傷心肌具有一定的保護作用。