豬偽狂犬病毒TaqMan 熒光定量PCR 檢測方法的建立及其凍干檢測試劑的制備

侯月娥1，葉 平2，伍建敏1,王鳳求1，趙玉林1，王貴平1，李中圣1

（1.廣東海大畜牧獸醫研究院，廣州511400;2.桂林聯勤保障中心第二儲備資產管理局，廣州510440）

豬偽狂犬病是一種由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染導致的急性、熱性傳染病。除高級靈長類以外，PRV能夠感染大部分哺乳動物[1]。豬是PRV的天然宿主和貯存宿主，不同日齡的豬感染PRV后表現出不同的癥狀。哺乳仔豬感染PRV后多表現為高熱和神經癥狀，常常出現整窩集中發病，15日齡以內的仔豬死亡率可達100%[2]。隨著日齡的增加，豬感染PRV后死亡率迅速降低，斷奶階段死亡率下降到30%以下。保育育肥豬感染PRV后多見發熱和呼吸道癥狀，耐過后生長遲緩多成為僵豬。母豬初次感染PRV往往呈一過性發熱，妊娠母豬會出現流產，產死胎等癥狀[3]。PRV已給全球養豬業造成了巨大的經濟損失。美國和歐洲各國通過使用優質的基因標記疫苗和相應的鑒別診斷方法，已很好的控制或凈化了豬偽狂犬病[4-6]。但在多數發展中國家，豬偽狂犬病仍頻繁發生。我國PRV仍呈流行趨勢，嚴重制約著養豬業的健康發展。對PRV感染早期進行及時、快速、準確的診斷，是有效防制豬偽狂犬病的重要前提。

gE、gI和TK基因是PRV的主要毒力相關基因，世界各國廣泛使用的PRV基因缺失疫苗多為gE、gI基因缺失表型或gE、TK雙基因缺失表型，以及gE、gI和TK三基因缺失表型[7-9]。PRV傳統診斷方法包括病毒的分離、動物接種試驗、ELISA、病毒中和試驗、乳膠凝集試驗、膠體金免疫層析試驗、血凝與血凝抑制試驗以及普通PCR等方法，這些方法存在耗時長，敏感性低，易出現假陽性，不能定量，試劑不方便運輸等缺點，給PR早期隱性感染的診斷帶來一定難度[10]。本研究在實時熒光定量PCR方法構建成功的基礎上，將除核酸以外所有試劑加入保護劑進行凍干，更方便快捷，適用于PRV的快速檢測和流行病學調查，從而為PR的預防和控制提供幫助。

1 材料與方法

1.1 病毒株、菌株及質粒 PRV、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）均由廣東海大畜牧獸醫研究院保存；豬偽狂犬活疫苗科偉凈（HB2000株）和科衛寧（HB-98株）購自武漢科前生物股份有限公司；豬偽狂犬活疫苗偽美瑞（Bartha-K61株）購自哈爾濱維科生物科技開發公司；豬偽狂犬活疫苗豬克偽（Bartha-K61株）購自珠海市安富來物科技有限公司；大腸桿菌DH5α和pMD-18T載體購自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑 體液病毒DNA小量制備試劑盒購自Axygen公司；Taq酶、dNTP購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒以及普通質粒小量提取試劑盒均購自Omega公司；凍干保護劑由廣東海大集團畜牧和水產研究中心提供。

1.3 引物和探針的設計及合成 根據PRV（AY170318）的核酸序列，利用Beacon Designer 7設計軟件，設計針對PRV gE基因特異性引物和熒光探針（表1），引物和探針由上海Invitrogen公司合成。

表1 PRV的熒光定量PCR探針及擴增引物Table 1 PRV primers and fl uorescent probes of real-time PCR

1.4 PRV總核酸提取及模板的制備 參照病毒DNA小量制備試劑盒說明書提取病毒傳代細胞中的總核酸，－80℃保存備用。

1.5 PRV基因片段克隆及標準品的制備 以PRV的DNA為模板，PRV-F/PRV-R（10 pmol/L）為引物進行PCR擴增。擴增條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環；72℃再延伸6 min。PCR擴增產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將切膠純化的PCR產物分別克隆至pMD-18T載體中，構建重組質粒pMD-PRV。將陽性的重組質粒測序鑒定，并采用核酸蛋白檢測儀測定重組質粒濃度，換算成拷貝數。

1.6 TaqMan實時熒光定量PCR擴增反應條件的優化PRV的引物和探針終濃度為0.1～0.6 μmol/L，退火溫度為55℃～65℃，以不同濃度配比和不同的退火溫度進行熒光定量PCR反應，選擇效果最佳的引物、探針濃度及退火溫度。

1.7 TaqMan實時熒光定量PCR標準曲線的構建 將1.5中制備的PRV標準品做10倍梯度稀釋，用不同稀釋梯度的重組質粒作為模板，每個梯度的質粒設立3個重復。使用優化的反應體系進行實時熒光定量PCR擴增。熒光定量PCR的反應條件：95℃預變性1 min，95℃變性10 s，退火溫度根據1.6摸索出來的最適溫度，40個循環，每個循環結束時進行熒光信號采集。

1.8 TaqMan實時熒光定量PCR特異性和敏感性檢測

1.8.1 特異性試驗 將提取的不同PRV疫苗株的DNA和CSFV、PRRSV反轉錄后的cDNA分別作為模板進行PCR擴增，驗證其特異性。

1.8.2 敏感性試驗 將測定好質粒濃度的模板進行10倍梯度稀釋，利用PRV凍干檢測試劑測定其敏感性。與本實驗室已經建立的PRV普通PCR檢測結果進行敏感性比較。

1.9 反應試劑凍干品的制備

1.9.1 凍干保護劑的優化 將凍干保護劑稀釋為4組不同的濃度（10、8、5、1.25 μmol/mL），與配制好的反應試劑混勻，然后進行無菌分裝，200 μL的8連管中，每管加入100 μL反應液（相當于20 μL的反應體系）。分裝后于－80℃冰箱冷凍3 h，完全冷凍后，開蓋放于已經調試好的Triad冷凍干燥器里面進行冷凍干燥。待程序停止后，根據凍干樣品物理性狀選擇最佳的一組。

1.9.2 PRV凍干檢測試劑的使用方法 將凍干試劑用16 μL滅菌去離子水進行溶解，加入2 μL陽性對照品，同時用滅菌的去離子水作為陰性對照，每管20 μL，封蓋混勻離心。熒光定量PCR的反應條件均為：95℃預變性1 min，95℃變性10 s，退火溫度根據1.6摸索出來的最適溫度，40個循環，每個循環結束時進行熒光信號采集。

1.10 PRV凍干檢測試劑保存期試驗 將凍干檢測試劑分別放置于室溫25℃和37℃保存，定期對其敏感性進行檢測，考察不同保存條件對敏感性的影響。

1.11 PRV凍干檢測試劑在手持式熒光PCR儀上的試驗 手持式熒光PCR儀為單通道PCR儀，將1.5制備的PRV標準品做10倍梯度稀釋，用不同稀釋梯度的重組質粒作為模板，根據其已有內置程序進行熒光PCR擴增，收集熒光信號進行定性檢測。

1.12 臨床樣本的檢測試驗 選取經過檢測的PRV陽性樣品30份，PRV可疑樣品27份，未經檢測樣品40份，累計97份，樣品均來自廣東省，采用本次構建的凍干檢測試劑對臨床樣品進行檢測，驗證該方法的靈敏性和特異性。

2 結果

2.1 重組質粒標準品的制備 以合成的PRV引物進行PCR擴增，擴增產物經電泳檢測后，切膠純化回收PCR產物，分別與pMD-18T載體連接，構建重組質粒pMD-PRV，對陽性重組質粒進行測序鑒定。結果顯示，PRV引物能擴增出相應的目的片段（圖1）。

圖1 PRV陽性重組質粒的鑒定Fig. 1 Identifi cation of PRV positive recombinant plasmids

2.2 TaqMan實時熒光定量PCR擴增反應條件的優化PCR反應中引物、探針的不同終濃度和不同的退火溫度都會引起Ct值的不同，PRV-F/PRV-R的終濃度為0.3 μmol/L，探針終濃度為0.2 μmol/L，退火溫度為60℃時，對同一標準品的檢測信號值最強，Ct值最小。

2.3 TaqMan實時熒光定量PCR標準曲線的構建 質粒濃度為1×106～1×101copies/μL的6個線性梯度時，標準曲線呈等距性和平行性，具有較好的梯度性（圖2）。

圖2 PRV TaqMan實時熒光定量PCR標準曲線Fig. 2 The standard curve of TaqMan real-time PCR for PRV

圖3 PRV TaqMan實時熒光定量PCR的特異性檢測Fig.3 Specifi city of PRV TaqMan real-time PCR

2.4 TaqMan實時熒光定量PCR特異性試驗和敏感性試驗

2.4.1 特異性試驗 將提取的PRV野毒、基因缺失活疫苗的DNA以及CSFV和PRRSV病毒核酸反轉錄的cDNA作為模板進行PCR擴增，結果顯示，僅PRV野毒的熒光信號為陽性，其他疫苗株和另外兩種病毒的檢測均為陰性，說明建立的TaqMan熒光定量PCR特異性較強，與其他病毒的基因沒有交叉反應，可用于臨床野毒檢測（圖3）。

2.4.2 PRV TaqMan熒光定量real-time PCR敏感性試驗 對PRV的反應標準重組質粒進行系列稀釋，結果顯示，實時熒光定量PCR的最低檢測量為10 copies/μL（圖4）。與實驗室已經構建的PRV普通PCR檢測結果進行比較，本研究建立的實時熒光定量PCR是普通PCR敏感性的100倍（圖5）。

圖4 PRV實時熒光定量PCR的敏感性檢測Fig.4 Sensitivity of PRV TaqMan real-time PCR

圖5 普通PRV標準品敏感性試驗Fig.5 Sensitivity of the normal PCR for PRV detection

2.5 PRV凍干保護劑的優化 優化試驗結果顯示保護劑濃度達到8 μm/mL時，和不加保護劑的反應Ct值相同（圖6），故將保護劑濃度定為8 μm/mL。該組凍干形態上也較好（圖7）。

2.6 PRV凍干檢測試劑保存期試驗 結果顯示在室溫25℃下存放6個月，37℃存放15 d和最初的檢測結果沒有差異，敏感性都可以達到10 copies/μL（表2）。由此說明，PRV的凍干檢測試劑在這兩種存放條件下的敏感性并未降低，質量穩定。

2.7 手持式熒光PCR儀檢測結果和熒光定量PCR結果的比較 利用PRV凍干檢測試劑，采用手持式熒光PCR儀對PRV標準品進行定性檢測，并與TaqMan熒光定量PCR結果進行對比，結果顯示手持式熒光PCR儀檢測結果與熒光定量PCR檢測結果相一致，表明凍干檢測試劑也可以應用于手持式熒光PCR儀。

圖6 PRV凍干保護劑的優化Fig.6 Optimization of the freeze-dried protective agent

圖7 PRV 凍干檢測試劑凍干后的物理性狀Fig.7 The physical characters of the freeze-dried detection reagent for PRV

表2 PRV凍干檢測試劑不同保存條件下的敏感性試驗Table 2 Specifi city of the freeze-dried detection reagent after storage under different conditions

2.8 臨床樣品檢測結果 對30份普通PCR鑒定的已知臨床病料和27份可疑臨床病料，以及未知的40份病料進行檢測，結果顯示，30份陽性病料，病毒拷貝數在4.1×104～2.1×107copies/μL（超過以及等于106copies/μL的樣品，均稀釋100后再次檢測），符合率為100%。27份可疑病料檢測結果顯示9份感染PRV，病毒拷貝數在1.3×102～3.7×103copies/μL，陽性率為33.33%。40份未驗證病料的檢測結果顯示，陽性感染的有18份，病毒拷貝數在2.7×102～6.4×108copies/μL，感染率為45%，而普通PCR僅檢測出11份，感染率為27.5%。

表3 手持式熒光PCR儀和熒光定量PCR檢測結果的比較Table 3 Comparison of detection result of handheld real-time PCR device and TaqMan real-time PCR

3 討論

豬偽狂犬病是危害我國養豬業最重要的傳染病之一，可引起母豬流產、死胎、木乃伊胎，初生仔豬大批死亡，成年豬則呈隱性感染，長期帶毒排毒，并且同引起繁殖障礙疾病的病毒病臨床癥狀相似，容易產生其他細菌性疾病的繼發感染，使病情惡化不利于臨床診斷。豬偽狂犬病嚴重影響種豬場生產及優良品種的推廣，給養豬業造成極大的損失[11]。因此，對PRV進行快速、及時、準確的診斷，是有效防治PR的重要前提。PRV檢測方法有病毒分離、gE抗體檢測、常規PCR檢測、中和試驗、細胞免疫等，但這些方法耗時較長，敏感性和特異性存在不足。熒光定量PCR不僅可對核酸進行定量檢測，而且靈敏度高，特異性強，實時性好，耗時短，自動化程度高，能同時檢測多份樣品[12]。定量檢測可以對疫病進行預警預報，為防控和治療贏得時間，并且在研究病毒對機體持續性感染方面具有重要意義[13-14]。

冷凍干燥技術是提高生物制品穩定性的通用方法，也為分子診斷試劑的長期保存提供了有效途徑[15]。本研究通過對PRV gE基因的保守序列進行了特異性的探針和匹配引物的設計，并對反應體系和反應條件進行了反復調整和優化，最終確定了最佳反應條件。在優化的基礎上將除核酸以外的所有成份（含保護劑）進行冷凍干燥。根據檢測結果最終確定了最佳保護劑組合和凍干條件。干燥好的凍干檢測試劑可以常溫運輸和短時間保存，不會影響其性能，直接用滅菌的去離子水進行溶解后，添加所需檢測的DNA，置于熒光定量PCR儀，通過分析軟件能直觀詳細記錄整個PCR過程，不需要進行反轉錄和瓊脂糖凝膠電泳，有效減少假陽性和污染發生，并且簡單快捷，對工作人員的專業要求不高。利用標準曲線，可以直接從軟件上得到病毒的準確拷貝數。

趙麗等[16]和田云等[17]建立的PRV熒光定量檢測方法特異性和敏感性均較好，但是操作繁瑣，試劑必須低溫保存，不方便運輸，不便于普及。本研究制備的凍干檢測試劑可以在常溫下操作而不影響其敏感性，也可以利用手持式熒光PCR儀來進行檢測。本研究基于TaqMan熒光定量PCR檢測方法，結合核酸擴增體系凍干工藝制備的PRV PCR凍干試劑彌補了傳統檢測方法重復性和耗時長的不足，同時具有較高的特異性，對于PRV早期診斷，致病機理研究以及防控技術研究等具有重要意義。