番鴨細小病毒LAMP檢測方法的建立

孟 婷，朱善元，夏文龍，左偉勇，王永娟

（江蘇農牧科技職業學院 江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室，泰州 225300）

番鴨細小病毒病是由番鴨細小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）感染引起的以腹瀉和喘氣為主要癥狀的急性或亞急性傳染病[1-3]。該病主要危害30 日齡以內的雛番鴨，特別是1～3 周齡的雛番鴨，因此俗稱“三周病”。MDPV傳播迅速，常引起鴨群發病和成群死亡，發病率和死亡率都很高。日齡較大的雛鴨感染MDPV后一般癥狀較輕，病死率較低，但病愈后大部分生長發育受阻，成為僵鴨。目前番鴨細小病毒病已經成為危害我國養鴨業發展最為嚴重的傳染病之一[4-6]。MDPV檢測方法中血清中和試驗、瓊脂擴散試驗、ELISA等[7]方法靈敏性低，周期長，重復性差，不易標準化，難以大范圍推廣使用；常規PCR和熒光定量PCR技術具有靈敏度高，特異性強等特點，但所需實驗設備和試劑往往比較昂貴，對操作員要求較高，不能滿足基層獸醫站或養殖場臨床一線簡便、快速檢測的需要[8]。

環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的恒溫核酸擴增技術，它依賴于能夠識別靶序列6 個特異區域的4 條引物和一種具有解旋功能的BstDNA聚合酶，能夠在恒定溫度下，短時間內實現核酸的指數級擴增。LAMP以其簡便、快速、高效、靈敏、特異等諸多優點受到越來越多獸醫工作者的關注，并在一些病原微生物的檢測中得到應用推廣[9-11]。本研究通過對MDPV的VP3基因保守序列的分析，設計了一組特異性引物，建立了MDPV的LAMP快速檢測方法，為將來MDPV的快速檢測試劑盒研制提供了科學依據。

1 材料和方法

1.1 病毒株 鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）、鴨瘟病毒（Duck plague virus, DPV）和番鴨細小病毒（Muscovy duck parvovirus, MDPV）由中國農業科學院上海獸醫研究所惠贈；小鵝瘟病毒（Goose parvovirus, GPV）和新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）購自中國獸醫藥品監察所，保存于-80℃。

1.2 試劑及器材BstDNA聚合酶（大片段）、SYBR Green I 染料購自New England Biolabs公司；MgSO4、甜菜堿購自天根生化科技（北京）有限公司；病毒基因組提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；dNTP、DNA Marker購自TaKaRa公司； DEPC水購自Sigma公司；2×LAMP Master Mix（含染料）購自康為世紀生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3 引物設計與合成 根據MDPV的VP3基因序列（GenBank登錄號：AY496895.1），選取一段高度保守的區域，使用Primer Premier 5.0軟件設計上游引物F和下游引物R（表1）；使用在線引物設計軟件Primer Explorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）設計LAMP引物，其中包括2條外引物F3/R3以及2 條內引物FIP/RIP。引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成（表1）。

表1 引物序列Table 1 Primer Sequences

1.4 病毒核酸的提取 參照上海生工柱式病毒抽提純化試劑盒說明書，分別提取番鴨細小病毒（MDPV）、鴨肝炎病毒（DHV）、新城疫病毒（NDV）、小鵝瘟病毒（GPV）和鴨瘟病毒（DPV）的基因組，將DHV和NDV的RNA反轉錄為cDNA，所有DNA/cDNA置于-80℃保存備用。

1.5 LAMP反應體系的建立及優化

1.5.1 反應體系的優化 在總反應體系25 μL，模板1 μL的條件下，依次對LAMP反應體系中的鎂離子濃度、引物濃度、dNTPs濃度、甜菜堿濃度進行優化，具體濃度比例如下：鎂離子濃度為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 mmol/L；內引物濃度為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 μmol/L；dNTPs濃度為0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol/L；甜菜堿濃度為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L。反應液均在冰盒上配制，輕輕混勻后瞬時離心，于65℃恒溫水浴鍋中反應90 min，反應結束后取10 μL反應液進行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.5.2 最佳反應溫度的確定 優化后的反應體系分別在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃溫度下進行反應，結束后吸取10 μL反應液進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.5.3 最佳反應時間的確定 優化后的反應體系分別反應15、30、54、60、75、90 min，結束后吸取10 μL反應液進行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.6 PCR方法的建立 以提取的MDPV核酸為模板，采用引物PCR-F / PCR-R（見表1）進行VP3基因擴增。PCR反應體系為25 μL：2×LAMP Master Mix（含染料）12.5 μL、核酸模板1 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共30個循環；72℃終延伸5 min。

1.7 LAMP的靈敏性檢驗 將抽提的MDPV核酸模板進行10 倍梯度稀釋，最終為1×103、1×102、1×101、1×100、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4ng/μL，分別以各稀釋度核酸DNA作為模板，按照前期優化好的LAMP檢測方法進行靈敏性試驗。同時取各稀釋度的核酸模板進行PCR檢測，比較兩者的靈敏性。

1.8 LAMP的特異性試驗 分別以MDPV、DHV、NDV、GPV和DPV的DNA/cDNA為模板，利用本研究建立的LAMP進行檢測，擴增產物經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結果

2.1 LAMP反應條件的優化結果 通過對反應體系的調整優化，最終確定LAMP反應體系為25 μL：8 U/μLBstDNA聚合酶、2.5 μL 10×Bst buffer、4 μL 25 mmol/L MgSO4、2 μL 20 μmol/L FIP/RIP、0.5 μL 20 μmol/L F3/R3、2 μL 25 mmol/L dNTPs、2 μL 5 mol/L 甜菜堿、1 μL 模板DNA，加ddH2O補足至25 μL；63℃反應60 min為最優反應條件（圖1）。

2.2 LAMP方法靈敏性檢測 以提取的MDPV核酸為模板，PCR擴增部分VP3 基因序列，電泳結果顯示在900 bp左右可見一清晰條帶，與預期相符（圖略）。所建立的LAMP方法對MDPV DNA的最低檢測限為1×10-2ng/μL（圖2A），與建立的PCR方法相同（圖2B）。

圖1 LAMP反應體系的優化Fig.1 Optimization of LAMP reaction system

2.3 LAMP方法特異性試驗結果 利用建立的LAMP方法分別對MDPV、DHV、NDV、GPV和DPV的DNA/cDNA模板進行檢測，擴增結果如圖3。結果顯示，建立的LAMP僅對MDPV擴散出特異性條帶，其他均為陰性。

圖2 PCR(A)和LAMP(B)方法檢測MDPV的靈敏性比較Fig.2 Sensitivity analysis of LAMP assay(A) and PCR assay(B) for MDPV

圖3 LAMP方法檢測MDPV的特異性Fig.3 Specifi city of LAMP assay for MDPV

3 討論

近年來，番鴨細小病毒病的發病率呈逐年上升趨勢，對養鴨業的危害日益嚴重。但是，目前尚無針對本病的特異性治療方法，盡快發現并隔離病鴨或帶毒鴨，提早預防是控制疫情的有效方法。因此，建立一種快速簡便的診斷方法顯得尤為重要。

本研究通過對MDPV的VP3基因保守序列的分析，利用LAMP引物設計軟件設計了一組特異性的引物，對反應體系及反應條件進行逐一優化調整，建立了MDPV的LAMP快速檢測方法。從病料處理、核酸提取、等溫擴增到最終結果判定可在1.5 h內完成，與PCR和熒光定量PCR相比，用時縮短了一半以上，更加適應臨床一線對快速檢測的需要。LAMP所用BstDNA聚合酶在恒溫條件下具有核酸擴增作用，有效避免了Taq酶在反應過程中必須精確升降溫的弊端。

綜上所述，本研究建立的LAMP檢測方法具有靈敏、特異、簡便、快捷等特點，適用于野外或臨床一線的快速檢測。同時，也為其他相關病原的檢測提供了新的思路和方法。