堿性蛋白酶交聯聚集體的制備及其催化性能研究

區曉陽, 曾英杰, 彭 飛, 倪子富, 熊 雋, 宗敏華, 婁文勇,2,*

(1.華南理工大學 食品科學與工程學院, 廣東 廣州 510640；2.華南協同創新研究院 生物活性分子開發與應用創新中心, 廣東 東莞 221116)

堿性蛋白酶作為一種重要的生物催化劑，屬于絲氨酸內肽酶，是一類最適pH值為堿性的蛋白酶。堿性蛋白酶具有催化水解蛋白質的氨基酸酰胺鍵、酯鍵，并具有轉酯和轉肽的能力[1]，能將一些蛋白質水解成多肽或氨基酸。堿性蛋白酶主要來源于細菌、酵母菌等微生物，具有產量大且蛋白分離純化方便等優點，被廣泛應用于食品、醫藥、釀造、絲綢等行業[2-4]。

游離堿性蛋白酶存在穩定性差、不可回收、產品分離困難等缺點，阻礙了其在工業上的應用，而酶的固定化技術可以克服這些障礙[5-7]。在固體載體上固定酶會導致非催化載體占據大量空間(約占總質量的90%～99%)，從而降低體積活性、時空產率和催化劑生產率[8]；此外，載體通常比較昂貴，且需要對惰性基質進行化學修飾后才能實現與酶的共價偶聯。交聯酶聚集體(CLEAs)是一種無載體固定化技術，通過對酶進行沉淀和加入交聯劑(如戊二醛等)后，戊二醛的兩個醛基分別與酶分子表面的氨基形成希夫氏堿反應，中間以5個碳原子連接在一起[9]。與有固體載體結合的固定化技術相比，CLEAs具有更突出的優勢，催化劑具有高體積活性，這是因為避免了引入惰性載體而造成酶活性降低[10]。交聯酶制備步驟簡單(沉淀和化學交聯)[11-12]，出色的酶活回收率[13-14]，無需高純度酶[15]，并且所得到的CLEAs對高溫、有機溶劑和自保護水解造成的酶失活有很好的抵抗作用[16-18]，從而表現出很高的存儲穩定性和操作穩定性，使CLEAs得到廣泛應用。此外，CLEAs負載酶量高，酶活性損失小，并能有效避免固體載體的引入造成酶失活[15]。聚集體制備成大分子的結構會影響酶與底物分子的接觸，從而影響其催化活性，并且不同來源的酶對于制備CLEAs條件呈現較大的差異，這可能是其不具有普適性的原因，所以需要對制備條件(如沉淀劑的類型、濃度、交聯時間等)進行系統優化，以期獲取具有最高催化活性的CLEAs。

本研究擬對堿性蛋白酶進行沉淀，并加入交聯劑進行交聯，制備高效的堿性蛋白CLEAs，并對影響制備過程的因素進行系統研究；為了防止酶在沉淀過程中變性，利用糖作為穩定劑，輔助制備堿性蛋白酶CLEAs[19]，以期獲取更高的酶活回收率；研究堿性蛋白酶CLEAs水解催化酪蛋白的酶學性質，并與游離堿性蛋白酶的催化性質進行比較分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶(諾維信37071，180 U/mL)，購于諾維信公司(丹麥)；酪蛋白和戊二醛，購于Sigma公司。其他所有化學品純度均為分析純，并購買于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1堿性蛋白酶CLEAs的制備

向0.4 mL游離堿性蛋白酶中滴加一定量的沉淀劑(8種)，將混合物在25 ℃下用磁力攪拌器攪拌5～30 min，直到堿性蛋白酶完全沉淀。將一定量的交聯劑緩慢添加到混合物中，并在25 ℃下繼續攪拌一定時間，然后將懸浮液在4 ℃、10 000 r/min離心10 min，去上清液。得到的沉淀用磷酸鹽緩沖液(200 mmol/L，pH值7.5)清洗顆粒3次，再次離心得到沉淀并進行冷凍干燥處理，于4 ℃冰箱冷藏備用。

在沉淀過程中，使用糖來保護酶免受沉淀劑引起酶的過度脫水。40 mg的糖(包括葡萄糖、蔗糖、D-葡萄糖醇、半乳糖、三氯蔗糖和海藻糖)與100 μL游離酶混合后，在25 ℃、200 r/min下添加900 μL沉淀劑(叔丁醇、飽和銨或乙醇等)，繼續溫浴30 min。

1.2.2酶活性和蛋白質濃度的測定

蛋白質濃度根據Lowry方法測定，并使用牛血清白蛋白為標準品[20]。以酪蛋白為底物，測定了游離酶和固定化堿性蛋白酶的活性。用紫外分光光度計測定280 nm下酪氨酸的釋放量。一單位蛋白酶相當于釋放1 μg酪氨酸/(mL·min)所需的酶量，固定化酶酶活回收率計算方法見式(1)。

(1)

1.2.3游離酶及其CLEAs的特性分析實驗

以酪蛋白為模型底物，經堿性蛋白酶水解成為酪氨酸。研究游離酶和CLEAs的酶學性質，包括酶的最適溫度和pH值及其穩定性，酶的動力學參數和重復使用穩定性。

1.2.3.1 最適溫度和pH值的確定

將40 mg酪蛋白溶解于3.6 mL 200 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.8)，并加入0.4 mL游離堿性蛋白酶或CLEAs，在不同溫度(50～75 ℃)下測定游離堿性蛋白酶和CLEAs的最佳反應溫度。在60 ℃(游離酶)和65 ℃(CLEAs)條件下，將酶加入不同pH值(7.0～9.0)的底物溶液中，分別測定最佳反應pH值。

1.2.3.2 酶的動力學參數測定

在優化的反應條件下，將具有相同酶活單位的游離酶和堿性蛋白酶CLEAs分別加入不同質量濃度的酪蛋白(1～11 mg/mL)中，測定酶對底物的親和力(Km)和酶最大反應速度(Vmax)，并根據Hanes-Woolf圖計算表觀Km和Vmax值。

1.2.3.3 酶的穩定性測定

熱穩定性測定：在不同溫度(50～70 ℃)下，將含有4.5 U/mL CLEAs或游離酶和10 mg/mL酪蛋白的4 mL磷酸鹽緩沖液(200 mmol/L，游離酶pH值為7.5，CLEAs pH值為8.0)于磁力攪拌器中溫浴攪拌反應4 h，測定樣品中的剩余酶活性。

酸堿穩定測定：向4 mL不同pH值的磷酸鹽緩沖液(200 mmol/L)中加入含有10 mg/mL酪蛋白和4.5 U/mL的CLEAs或游離酶，混合液在25 ℃攪拌反應4 h，按1.2.2方法測定酶樣品的剩余酶活性。

1.2.3.4 酶的重復使用穩定性測定

將含有60 mg/mL酪蛋白的磷酸鹽緩沖液(200 mmol/L，pH值8.0)放置于65 ℃下進行催化反應，重復8批次(每批次反應1 h)。在各批次中，通過離心(10 000 r/min,25 ℃)回收CLEAs，并使用磷酸鹽緩沖液(200 mmol/L，pH值8.0)洗滌3次。將回收的CLEAs溶解在新的反應介質中，并將第一批CLEAs的相對酶活性定義為100%。

2 結果與討論

2.1 堿性蛋白酶CLEAs的制備及電鏡分析結果

2.1.1影響堿性蛋白酶CLEAs制備的因素分析

2.1.1.1 沉淀劑種類對堿性蛋白酶CLEAs制備的影響

CLEAs的制備包括聚集和交聯兩個步驟。在蛋白質水溶液中加入鹽、有機溶劑、非離子聚合物或酸引起的聚集是蛋白質沉淀的常用方法。本研究采用乙腈、叔丁醇、乙醇、飽和硫酸銨、丙酮、甲醇、異丙醇和聚乙二醇(PEG)作為沉淀劑來制備CLEAs，并測定其酶活回收率。沉淀劑對堿性蛋白酶CLEAs的酶活回收率的影響如圖1?？偟膩碚f，隨著沉淀劑濃度的增加，酶活回收率增加。與甲醇、乙醇等沉淀劑相比，以含有90%叔丁醇的溶液作為沉淀劑，可獲得堿性蛋白酶CLEAs的酶活回收率的最大值，達到91.6%。這是因為甲醇、乙醇等沉淀劑的極性強，剝奪了蛋白質表面的水化層，改變了酶的空間結構，使酶失活。沉淀條件的不同，制備得到的CLEAs的催化產率會有明顯的差異[11，21]。

圖1 不同沉淀劑對酶活回收率的影響Fig.1 Effect of different precipitants on enzyme activity recovery

2.1.1.2 糖作為沉淀輔助物對堿性蛋白酶CLEAs制備的影響

有研究表明，用糖作為輔助物能有效減少酶在沉淀過程中的活性損失[17,22]。在我們的研究工作中，多種糖已被用來保護酶因沉淀劑造成的過度脫水。以乙醇為沉淀劑時，酶活回收率較低，但糖加入對酶有一定的保護作用，可在一定程度上提高酶活回收率，見表1。與乙醇相比，以叔丁醇或飽和硫酸銨為沉淀劑時，糖輔助沉淀沒有明顯提高酶活性，可能是叔丁醇或飽和銨對酶活性損失影響較小。

表1 糖作為沉淀輔助物對聚集體重新溶解后

2.1.1.3 沉淀時間、交聯劑濃度和交聯時間對堿性蛋白酶CLEAs制備的影響

圖2 多種固定化因素對酶活回收率的影響Fig.2 Effects of several immobilization factors on enzyme activity recovery of CLEAs

為了獲得高效的堿性蛋白酶CLEAs，研究固定化過程中的關鍵參數(如沉淀時間、交聯劑濃度和交聯時間等)對酶活回收率的影響是非常重要的，實驗結果見圖2。圖2(a)中，CLEAs酶活回收率隨著沉淀時間的增加而增加，直至15 min，隨后繼續增加沉淀時間會使酶活回收率下降，這可能是由于酶在相對較長的沉淀時間(超過15 min)內部分失活所致。因此，將制備堿性蛋白酶CLEAs的最佳沉淀時間確定為15 min。

交聯劑通常在制備固定化酶的過程中起重要作用[23]。戊二醛被用作固定多種酶的理想交聯劑[24]，因此本研究利用戊二醛作為交聯劑來固定堿性蛋白酶以制備CLEAs。圖2(b)中，在較低的戊二醛濃度下，酶活回收率相當低，這是因為堿性蛋白酶交聯體的形成量少；但隨著戊二醛濃度逐漸增加到33 mmol/L時，CLEAs的酶活回收率不斷增加；戊二醛濃度進一步升高(超過33 mmol/L)，酶活回收率下降，這可能是由于過量的戊二醛導致酶部分失活。所以，將制備堿性蛋白酶CLEAs的最佳戊二醛濃度確定為33 mmol/L。戊二醛對堿性蛋白酶的影響趨勢與常見的實驗結果[25]大不相同，這表明了交聯時間過長會破壞酶的柔韌性，從而使酶活回收率降低。

圖2(c)表明，酶活回收率隨交聯時間的增加而顯著增加，直至6 h，繼續延長交聯時間則會使酶活回收率降低。這可能是由于在較長的交聯時間(6 h以上)內，酶的部分失活所致。顯然，堿性蛋白酶交聯體制備的最佳交聯時間為6 h。

對堿性蛋白酶制備過程中的影響因素分析表明，以體積分數為90%的叔丁醇作為沉淀劑，沉淀時間為15 min，交聯劑濃度為33 mmol/L，交聯時間為6 h時，堿性蛋白酶CLEAs的酶活回收率達最大值，為22.6%。

2.1.2電鏡分析結果

CLEAs是一種多孔結構聚合物，所制備的交聯體結構直接影響到酶的催化活性，如交聯體的孔道直徑會影響到酶與底物的接觸面積和底物與產物進出孔道的快慢。為了更直接觀察所制備的CLEAs形態特征，使用電子掃描電鏡(SEM)對所制備的CLEAs表面特征進行觀察(圖3)。CLEAs表面層次分明，皺褶片狀多，并有顆粒凸起，有許多大小不一的孔道，孔道直徑介于1～2 μm，表明所制備的CLEAs表面積大，有利于酶與底物的接觸。

圖3 CLEAs的SEM圖Fig.3 SEM images of CLEAs

2.2 游離酶及其CLEAs的特性分析結果

2.2.1酶的最適反應溫度和pH值

酶的催化活性與反應溫度和pH值密切相關，過高或過低都會影響酶的催化效率，因此，探索酶的最適反應溫度和pH值對更好發揮堿性蛋白酶CLEAs的催化性能及其應用具有重要意義。反應溫度和pH值對堿性蛋白酶CLEAs活性的影響見圖4。游離堿性蛋白酶的最適溫度為60 ℃，堿性蛋白酶CLEAs則為65 ℃(圖4(a))，這可能是由于戊二醛引起了蛋白質間共價鍵的形成，增加了酶構象的剛性，進而防止酶因熱交換而引起扭曲或破壞[26-27]。

pH值也是影響酶活性的主要參數之一。酶的固定化通常會導致酶的構象發生變化，從而導致最優pH值的變化。pH值對游離酶和CLEAs活性的影響見圖4(b)。游離酶的最適pH值為7.5，交聯后的堿性蛋白酶CLEAs則為8.0。pH值向堿性方向轉移是由于偶聯劑和酶之間的二次相互作用造成的。最適pH值的變化取決于酶和(或)基質的電荷，而戊二醛與酶偶聯會將酶表面所有可用的氨基連接起來，因此酶表面的酸性基團會使酶蛋白帶負電荷，最終將最佳pH值向堿性方向移動。

游離酶和CLEAs最高的酶活性定義為100%。圖4 反應溫度和pH值對游離酶與堿性蛋白酶CLEAs活性的影響Fig.4 Influences of various temperature and pH value on activity of free enzyme and alkaline protease CLEAs

2.2.2酶動力學研究結果

通過測定不同濃度酪蛋白在各最佳反應條件下(游離酶pH值7.5, 60 ℃；CLEAs pH值8.0, 65 ℃)的初始反應速率，比較了游離酶和堿性蛋白酶CLEAs的表觀動力學參數，見表2。CLEAs的Km值(2.3 mg/mL)低于游離酶(3.6 mg/mL)，說明CLEAs對底物的親和力增強。CLEAs的Vmax為9.8 mg/(mL·min)，低于游離酶的13.3 mg/(mL·min)。酶通過固定化后會造成其構象發生變化，使酶的活性位點更適合與底物結合[28]。CLEAs的催化效率(Vmax/Km)高于游離酶(3.7 min-1)，說明CLEAs具有更高的催化效率。游離酶的活性位點具有不同的走向，但經過交聯固定化后，酶的活性位點排列有序，更容易與底物結合，效率更高。

2.2.3酶的熱穩定性和酸堿穩定性分析為了更好地了解固定化堿性蛋白酶CLEAs的特性，研究其在不同溫度和pH值下的穩定性。圖5(a)是CLEAs和游離酶在不同溫度(50～70 ℃)下的穩定性情況。結果表明，CLEAs的耐熱性強于游離酶。由于游離酶穩定性差，部分酶在高溫下溫浴4 h后迅速失活。在相對較高的溫度(70 ℃)下，固定化堿性蛋白酶CLEAs的初始酶活性至少保留了70.2%，而游離酶的相對活性僅為41.1%左右。結果表明，CLEAs具有較高的耐熱性，這可能與CLEAs中的共價鍵有關。

圖5 CLEAs和游離酶的熱穩定性和酸堿穩定性Fig.5 Stabilities of CLEAs and free enzyme under different buffer pH value and temperatures

酶制劑Km/(mg·mL-1)Vmax/(mg·(mL·min)-1)Vmax/Km/min-1游離酶a3.613.33.7CLEAsb2.39.84.3

a:最優反應條件為pH值7.5，60 ℃；b: 最優反應條件為pH值8.0, 65 ℃。

圖5(b)表明，堿性蛋白酶CLEAs在pH值為7.0～9.0時，比游離酶更穩定。在所測定的pH值范圍中，CLEAs的活性都要高于游離酶，而且，pH值越大，CLEAs的穩定性比游離酶越明顯。CLEAs的酸堿穩定性有所提高，可能是由于酶聚集體之間的共價交聯造成的[29]。

2.2.4固定化酶CLEAs的重復使用穩定性分析

堿性蛋白酶CLEAs的重復使用穩定性是衡量固定化酶優劣的關鍵因素,因此生物催化劑的重復使用性能是固定化酶的一個重要指標[30]。以生物催化水解酪蛋白為模型反應，研究了堿性蛋白CLEAs的重復使用實驗，結果見圖6。圖6表明，在磷酸鹽緩沖液中重復使用5批次和8批次后，堿性蛋白酶CLEAs的剩余酶活性分別保持在82.5%和56.5%以上。由于堿性蛋白酶CLEAs具有易分離、穩定性好、可重復利用等特點，在生物水解工業上將具有更大應用潛力。

圖6 堿性蛋白酶CLEAs水解酪蛋白的重復使用穩定性Fig.6 Reuse stability of alkaline protease CLEAs for enzymatic hydrolysis of casein

3 結 論

通過對堿性蛋白酶固定化條件的優化，得到最佳沉淀劑為體積分數為90%的叔丁醇，最佳沉淀時間為15 min，最佳交聯劑濃度為33 mmol/L，最佳交聯時間為6 h，最大堿性蛋白酶CLEAs的酶活回收率為22.6%。下一步實驗可以利用其他固定化方法(如磁性纖維納米晶)對堿性蛋白酶進行固定化，進一步提高堿性蛋白酶酶活回收率。雖然實驗過程中酶活回收率較低，但未固定上的堿性蛋白酶能用其他試劑(如飽和硫酸銨)沉淀析出，回收后可繼續重復利用，減少酶的浪費。堿性蛋白酶CLEAs的催化性能(如最適催化溫度和pH值)得到一定程度的提高，最適催化溫度由60 ℃提高65 ℃，最適反應pH值也由7.5提高到8.0。不但如此，堿性蛋白酶CLEAs的熱穩定性和酸堿穩定性也明顯優于游離酶，且CLEAs的Km值(2.3 mg/mL)低于游離酶(3.6 mg/mL)，這表明CLEAs對酪蛋白具有更高的結合能力，所制備的固定化酶更符合工業用酶的苛刻要求。此外，堿性蛋白酶的CLEAs具有良好的重復使用穩定性，重復利用5和8批次后，CLEAs的剩余酶活性還能保持82.5%和56.5%以上。所制備的堿性蛋白酶CLEAs在食品、醫藥、釀造等行業的具體應用有待進一步研究，但其簡單的制備和回收步驟，優異的催化性能和穩定的操作性都表明，堿性蛋白酶CLEAs的優越性要高于游離酶，這將會使其在生物催化工業上具有更大的應用潛力。