不同β-葡萄糖苷酶性能分析及對羅漢果苷的轉化

李登科, 王欣馳, 陳雪佳, 李家霖, 胡小妍, 路福平， 李 玉

(天津科技大學 生物工程學院/工業發酵微生物教育部重點實驗室， 天津 300457)

羅漢果苷為羅漢果中研究最多的活性成分，具有消炎、止咳、護肝、降糖、抗疲勞、增強免疫等顯著功能[1]。1983年，日本人竹本首次采用光譜和化學分析法鑒定了羅漢果醇及其甙的結構[2]，之后陸續分離和鑒定出30多種甜味化合物羅漢果苷[3-4]。羅漢果苷V是成熟的羅漢果的主要成分，其甜度是蔗糖的250～400倍，在人體代謝過程中不需要胰島素的參與[5]，是肥胖以及糖尿病等不宜攝糖人群理想的糖替代品[6]。由于這些羅漢果苷均為葫蘆烷型四環三萜類的衍生物，區別在于R1和R2兩處所鏈接的葡萄糖基不同，因此結構上的相似性對其分離純化造成了一定的干擾[7]，加之羅漢果醇、羅漢果苷ⅢE、羅漢果苷ⅡE等在羅漢果中的含量少，導致其價格偏高，對其功能的深入研究也少有報道[8]。因此實現羅漢果苷的定向轉化，生成特定的羅漢果苷及其類似物，為進一步探究其作用機制提供原料具有重要意義。

目前，羅漢果苷的獲得主要通過從原料中直接提取、化學合成和酶法合成等方法[9]。從羅漢果中提取的羅漢果苷是市場上最常見的產品，但此類產品加工技術過于粗糙，技術指標也較為廣泛，可信值大大降低。微生物酶法轉化具有反應條件溫和、專一性強、環境友好等優點[10]。β-葡萄糖苷酶可水解結合于末端的非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，釋放出葡萄糖和相應的配基[11]。由于β-葡萄糖苷酶廣泛的底物特異性，可作用于β-(1,1)、β-(1,2)、β-(1,3)、β-(1,4)和β-(1,6)糖苷鍵[12]，有的β-葡萄糖苷酶還具有轉移葡萄糖基的作用[13]，因此可利用不同來源β-葡萄糖苷酶的底物特異性來進行羅漢果苷的轉化，提高稀有結構羅漢果苷的含量，為羅漢果苷的功能研究奠定基礎[14]。本研究擬利用畢赤酵母表達系統對不同來源的β-葡萄糖苷酶進行異源表達，并對其酶學性質進行分析，初步確定轉化的最佳條件。以羅漢果苷Ⅴ為底物進行酶法轉化，探究酶水解性能的差異和特異性，希望為酶法制備羅漢果苷及其結構類似物提供新的來源和途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌JM109、畢赤酵母GS115、黑曲霉TCCC 41063和表達載體pPIC9K均為天津科技大學生物工程學院菌種保藏中心保藏。酵母粉、蛋白胨，購于Oxoid公司；質粒抽提試劑盒、DNA純化試劑盒等，購于美國Omega公司；標準品羅漢果苷ⅢE、Ⅳ、Ⅴ，購于成都普瑞發科技開發有限公司。其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器

Bio電擊轉化儀和S1000型PCR型基因擴增儀，美國Bio-Rad公司；MaxQ6000型恒溫調速搖床，美國Thermo Scientific公司；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Milli-Q型超純水系統，天津市奧佳科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1重組菌株的構建

將不同來源的β-葡萄糖苷酶基因進行合成或采用PCR技術從實驗室保藏菌種中擴增，得到目的基因。其中來源于特異腐質霉Humicolainsolens的β-葡萄糖苷酶基因(bglHi)，來源于棘孢曲霉Aspergillusaculeatus的β-葡萄糖苷酶基因(bglAa)，由蘇州金唯智生物科技有限公司優化合成。黑曲霉Aspergillusniger來源的β-葡萄糖苷酶基因(bglAn)通過PCR擴增得到，其引物序列為：F：CGCGAATTCGCTGATGAATTGGCCTAC；R：CTAGCGGCCGCTTAGTGAACAGTAGGCAG。將目的基因與載體pPIC9K連接構建重組質粒，化轉至大腸桿菌JM109。將構建正確的重組質粒線性化后電轉至畢赤酵母GS115中，經G418篩選后，通過PCR驗證轉化子。

1.3.2β-葡萄糖苷酶的誘導表達

將重組菌株的單菌落分別接到30 mL YPG培養基中，30 ℃、180 r/min培養16～18 h；按2%接種量分別將種子液接入50 mL BMGY液體培養基中，30 ℃，180 r/min培養至OD600達到5～6(約16～20 h)；收集菌液于滅菌的50 mL離心管中，8 000r/min，離心5 min，倒掉上清液，用20 mL BMMY培養基重懸菌體進行細胞洗滌，重復洗滌3次，最后用BMMY培養基重懸菌體(菌體終濃度OD600為1)；饑餓1 h后開始添加誘導劑甲醇，每隔24 h加入0.5%甲醇誘導表達，并定時取樣分析。

1.3.3β-葡萄糖苷酶活力的檢測

以對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)為底物，檢測β-葡萄糖苷酶的酶活力。pNPG的水解產物為對硝基苯(pNP)和葡萄糖，pNP在400 nm下有特異的吸光值，可以進行比色測定。將反應體系中每分鐘產生1 μmol pNP所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

繪制pNP的標準曲線：配制0.1 mg/mL對硝基苯酚母液，分別稀釋到質量濃度為0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 mg/mL。以無菌水為空白，在400 nm下測定吸光度值。以OD600值為縱坐標，pNP質量濃度(mg/mL)為橫坐標，做出pNP的標準曲線。

1.3.4不同來源β-葡萄糖苷酶酶學性質的分析

為了考察酶的最適溫度、熱穩定性、最適pH值和酸堿穩定性，按照1.3.3的方法在不同的溫度(30、40、50、55、60、65、70、75、80 ℃)和pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)下測定酶的活力。將最高酶活力設為100%，計算各條件下的相對酶活力，以確定酶的最適溫度和pH值。將酶置于酶的最適反應溫度附近，恒溫水浴處理10 h,每隔1 h測量酶的殘留活力，以確定酶的熱穩定性。將酶適當稀釋于pH值為3.0～8.0的緩沖體系中，置于4 ℃冰箱保存12 h，在不同pH值條件下測量酶的殘留活力，以確定酶的酸堿穩定性。

1.3.5不同來源β-葡萄糖苷酶水解羅漢果苷Ⅴ底物特異性分析

在酶的最適反應條件下，向10 mL的反應體系中加入2 U不同來源的β-葡萄糖苷酶(以100 ℃煮沸10 min的滅活發酵液上清液作為對照)，以質量濃度為1 mg/mL和5 mg/mL的羅漢果苷Ⅴ(40%)作為底物進行反應，定點取樣。繪制標準品羅漢果ⅢE標準曲線：配制1 mg/mL羅漢果ⅢE母液，分別稀釋至質量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL；以峰面積為縱坐標，羅漢果ⅢE的質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

HPLC檢測條件：色譜柱為ZORBAX SB-Aq 4.6 mm×150 mm×5 μm；柱溫為30 ℃；流動相為水(A相)和乙腈(B相)；梯度洗脫程序為0～3 min 20%B，3～8 min 30%B，8～9 min 35%B；流速為0.8 mL/min；檢測波長203 nm。

2 結果與分析

2.1 不同來源β-葡萄糖苷酶的克隆表達結果

2.1.1表達載體pPIPC9K-bgl的構建結果

將特異腐質霉、棘孢曲霉和黑曲霉來源的β-葡萄糖苷酶基因bglHi、bglAa和bglAn雙酶切后，與相同酶切后的載體pPIC9K片段相連，化轉至大腸桿菌JM109中，構建重組質粒pPIC9K-bglHi、pPIC9K-bglAa和pPIC9K-bglAn。用對應的限制性內切酶進行雙酶切鑒定，結果如圖1。泳道1顯示，在約1 400 bp和9 300 bp位置分別出現兩條電泳條帶，與基因bglHi(1 443 bp)和載體(9 276 bp)的大小一致；泳道2和3顯示出的約2 600 bp的條帶分別與基因bglAa(2 597 bp)和bglAn(2 583 bp)的大小一致，說明目的基因已成功插入到載體中。

圖2 重組轉化子的高拷貝篩選Fig.2 High copies screening of recombinant strains

泳道1: pPIC9K-bglHi；泳道2: pPIC9K-bglAa；泳道3：pPIC9K-bglAn；M: 1kb DNA ladder。圖1 重組質粒pPIC9K-bgl的雙酶切鑒定結果Fig.1 Identification of there combinant plasmids by double enzymes digestion

2.1.2重組畢赤酵母菌株GS115/pPIPC9K-bgl的篩選鑒定結果

分別提取構建成功的重組質粒pPIC9K-bglHi、pPIC9K-bglAa和pPIC9K-bglAn，用SacI線性化，電轉至畢赤酵母GS115感受態細胞中，涂布于MD營養缺陷型篩選板，30 ℃下培養2～3 d，至有單菌落產生。挑取重組畢赤酵母轉化子分別接種于質量濃度為0.5、1.0、2.0 mg/mL的YPD/G418抗性篩選平板上，進行抗性復篩，挑取在高濃度G418下生長狀態良好的單菌落，進行驗證和誘導表達，重組菌株分別命名為P.pastoris/pPIC9K-bglHi，P.pastoris/pPIC9K-bglAa，P.pastoris/pPIC9K-bglAn。以P.pastoris/pPIC9K-bglHi為例，圖2表明了重組菌株在不同濃度G418下的生長情況。挑取在G418質量濃度為2.0 mg/mL的YPD平板上菌落形態最大的單克隆，作為下一步的研究對象。

2.1.3不同來源β-葡萄糖苷酶的表達及酶活性分析結果

按照1.3.2的方法進行酶的誘導表達，發酵結束后離心取上清液，獲得粗酶液。3種不同來源的酶分別命名為BglHi，BglAa和BglAn，利用12%SDS-PAGE分析酶的表達情況，結果如圖3。泳道1為對照菌株GS115/pPIC9K的發酵上清液，泳道2為P.pastoris/pPIC9K-bglHi的發酵上清液，與泳道1相比，可見明顯的蛋白條帶，其表觀分子質量約為60 kDa。泳道3和4分別為P.pastoris/pPIC9K-bglAa和P.pastoris/pPIC9K-bglAn的發酵上清液，蛋白質的表觀分子質量約為135 kDa和120 kDa。采用軟件DNAman對不同來源β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列進行分析，預測其理論分子質量，結果顯示：BglHi、BglAa和BglAn的理論分子質量分別為54.05、93.05 kDa和93.25 kDa，其理論分子質量均小于表觀分子質量，這與畢赤酵母在表達分泌目標蛋白時會對其進行糖基化修飾有關[15-16]。按照1.3.3的方法，繪制pNP的標準曲線如圖4，其線性回歸方程為Y=39.43X-0.020 3；R2=0.998 9。以pNPG為底物，在pH值6.0、溫度50 ℃的條件下，反應5 min，測得BglHi，BglAa和BglAn三種酶的酶活力分別為25.97、40.69、90.83 U/mg。

泳道1：P. pastoris/pPIC9K對照；泳道2：P. pastoris/pPIC9K-bglHi的發酵上清液；泳道3：P. pastoris/pPIC9K-bglAa的發酵上清液；泳道4：P. pastoris/pPIC9K-bglAn的發酵上清液；M：蛋白Marker。圖3 重組畢赤酵母發酵上清液的SDS-PAGE分析結果Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant β-glucosidase expressed in P. pastoris GS115

圖4 pNP標準曲線Fig.4 Standard curve of pNP

酶活力計算公式見式(1)。

(1)

式(1)中，S：樣品的酶活力，U/mL；X：pNP質量濃度，mg/mL；V1：反應液體積，mL；V2：酶液的體積，mL；t：反應時間，min；n：稀釋倍數。

2.2 不同來源β-葡萄糖苷酶性質的測定結果

2.2.1溫度對酶活力的影響

溫度是影響酶催化反應的重要因素，為確定溫度對不同來源β-葡萄糖苷酶的影響，按照1.3.4的方法測定了不同溫度下β-葡萄糖苷酶的相對活力，以及在50、60、70 ℃下處理10 h后酶的相對活力隨時間的變化，實驗結果見圖5、圖6。由圖5可以看出，BglHi、BglAn和BglAa的最適溫度分別為55、60 ℃和65 ℃。由圖6可知，這3種酶均能在50 ℃時維持較好的穩定性，在50 ℃下處理10 h均可保持50%以上的相對酶活性，而在60 ℃和70 ℃時其穩定性欠佳。

圖5 不同來源β-葡萄糖苷酶的最適溫度Fig.5 Optimum temperatures of different β-glucosidase

2.2.2pH值對酶活力的影響

圖6 不同來源β-葡萄糖苷酶的熱穩定性Fig.6 Thermo stability of different β-glucosidases

為了探究pH值對酶活力的影響，測定了不同pH值時酶的相對活力和在不同pH值時處理12 h后酶殘余活力的相對值，實驗結果如圖7。圖7中，BglHi、BglAn和BglAa的最適pH值分別為6.0、5.5和5.0，與Yan等[17]的研究結果一致。這一結果在一定程度上表明，β-葡萄糖苷酶多為酸性酶，而這一特性有利于其在食品飲品加工及纖維素水解等過程中應用，因為該過程多發生在pH值為4.0～6.0[18]時。圖8顯示了酶的酸堿穩定性，其中BglHi和BglAa的酸堿穩定性較好。在pH值為4.0～8.0的緩沖液下處理12 h，均可殘留60%以上的酶活力，但BglAn在pH值為3.0～4.0時穩定性較差。

圖7 不同來源β-葡萄糖苷酶的最適pH值Fig.7 Optimum pH value of different β-glucosidases

圖8 不同來源β-葡萄糖苷酶的酸堿穩定性Fig.8 pH stability of different β-glucosidases

2.3 不同來源β-葡萄糖苷酶對羅漢果苷轉化性能的比較

按照1.3.5的HPLC檢測條件，繪制出羅漢果ⅢE的標準曲線，如圖9，其線性回歸方程為Y=2 806.2X+90.109；R2=0.999 2。檢測了BglHi、BglAa、BglAn在以1 mg/mL和5 mg/mL的羅漢果苷Ⅴ(40%)為底物時的轉化情況，實驗結果見圖10。以1 mg/mL的羅漢果苷Ⅴ(40%)為底物，在反應20 min時，均有轉化產物羅漢果ⅢE的生成。BglHi和BglAa轉化率分別為5.1%和6.37%。延長反應時間至12 h，未見其水解產物羅漢果ⅢE增多；然而BglAn將底物幾乎完全轉化為羅漢果ⅢE，轉化率為96.5%，如圖10(c)所示。增加底物羅漢果Ⅴ濃度，以5 mg/mL的羅漢果苷Ⅴ(40%)為底物，在反應30 min時，BglHi和BglAa轉化率分別為6.23%和6.89%，延長反應時間至12 h，未見其水解產物羅漢果ⅢE增多；而BglAn在1 h內隨反應時間的延長，產物羅漢果苷ⅢE明顯增多，轉化率依次為17.77% (5 min)、68.6% (30 min)、97.9% (1 h)，如圖10 (d～f) 所示。此結果可以證明，BglAn對羅漢果苷Ⅴ結構中3位和24位的β-1，6-糖苷鍵的專一水解性極強，可以有效地轉化生成羅漢果苷ⅢE。

圖9 羅漢果ⅢE標準曲線Fig.9 Standard curve of mogroside ⅢE

(a)羅漢果苷Ⅴ(6.068 min)、Ⅳ(6.735 min)、ⅧE(7.435 min)；(c)BglAn轉化1 mg/mL羅漢果苷Ⅴ； (d) (e) (f) BglAn轉化5 mg/ml羅漢果苷Ⅴ。圖10 轉化產物的HPLC分析結果Fig.10 HPLC analysis of transformation products

3 結 論

利用畢赤酵母GS115表達系統對來源于特異腐質霉、棘孢曲霉和黑曲霉的β-葡萄糖苷酶基因bglHi、bglAa和bglAn進行了異源表達。對不同來源的β-葡萄糖苷酶的酶學性質進行了研究。比較發現，3種來源的酶最適溫度均在55～65 ℃，并且在50 ℃下的穩定性均能保持在50%以上；3種酶的最適pH值范圍在5.0～6.0，同時酸堿穩定性都能保持在80%以上。以羅漢果苷Ⅴ為底物，通過對不同來源β-葡萄糖苷酶轉化性能的比較，發現來源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶BglAn在底物質量濃度為1 mg/mL時，20 min就可以將羅漢果苷Ⅴ幾乎全部轉化為羅漢果苷ⅢE，轉化率為96.5%；將底物濃度由1 mg/mL提高到5 mg/mL，60 min時，轉化率高達97.9%。另外兩種來源的β-葡萄糖苷酶BglHi和BglAa，僅能轉化生成少量的羅漢果苷ⅢE，轉化率為5%～7%。由此可以證明：來源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶BglAn對羅漢果苷Ⅴ結構中3位和24位的β-1，6-糖苷鍵有極高的專一水解性，并且轉化率極高，基本實現完全轉化，這極大地降低了羅漢果苷ⅢE后期分離和純化的難度，為實現羅漢果苷類物質的工業化生產提供了可能。