丁苯酞對兔視網膜缺血再灌注損傷中細胞凋亡的影響

張雅馨，蘇杰，黃帥，張新躍，劉穎，王林洪

作者單位：華北理工大學附屬醫院眼科，河北 唐山 063000

近年來，由多種缺血性眼病所引發的視網膜的缺血再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI)病例逐年增多，嚴重危害著病人的健康。視網膜是眼球后部的一層薄膜，可以看作是大腦的一部分，主要是由叢狀層和神經纖維層構成的白質、光感受器和神經節細胞構成的灰質和Müller細胞及小星型細胞構成的神經膠質組成，對缺血缺氧環境極為敏感，且易受損傷，而且主要供給視網膜血供的終末動脈—視網膜中央動脈極易發生阻塞、缺血，一旦發生便可極快地損傷視網膜。RIRI是臨床常見疾病，即缺血性眼病病人視網膜在恢復供血后，視功能不升反降，主要發生于糖尿病、視網膜中央靜動脈阻塞、缺血性病變、青光眼等疾病中，其視神經損害主要表現在視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell，RGC)的凋亡[1]，隋源等[2]研究指出，RIRI中神經元的丟失也主要集中體現在RGCs。因此，視網膜缺血性疾病的預防及早期治療極為重要。已有研究表明，丁苯酞對于腦缺血再灌注損傷中神經功能損傷具有很強的保護作用[3]，筆者自2016年11月至2017年1月就丁苯酞對RIRI中細胞凋亡的作用進行探討。

1 材料和方法

1.1 實驗動物健康雄性新西蘭白兔80只，體質量(2.5±0.5)kg，外眼及眼底檢查均正常，飼養環境相同，均由華北理工大學動物實驗中心提供。實驗中充分保證動物福利、給予動物人道關懷，動物處置也符合倫理學原則。

1.2 主要試劑丁苯酞(恩必普，石藥集團恩必普藥業有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；封閉用正常山羊血清工作液SP-9001(北京中杉金橋生物技術有限公司)；抗P53多克隆抗體、抗Bcl-2多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；山羊超敏二步法檢測試劑盒(二抗)(北京中杉)等。

1.3 模型制備采用前房高眼壓灌注法[4]制備缺血再灌注模型。術前給予丙美卡因點眼，復方托吡卡胺點眼至瞳孔完全散大后固定白兔，25%烏拉坦耳緣靜脈麻醉，劑量4 mL/kg。麻醉成功后，白兔取仰臥位，將4.5號頭皮針(連接250 mL 0.9%鹽水袋)刺入前房，鹽水袋垂直于兔眼，高度150 cm，此時眼底鏡可見視網膜缺血水腫、蒼白，持續1 h。對照組不予任何處理。氯霉素全程間斷點眼保持角膜濕潤，預防感染。

1.4 分組與給藥采用隨機數字表法將實驗動物分成對照組(10只)、RIRI組(35只)、給藥組(35只)三組，其中對照組再分為6 h、24 h兩個亞組(排除時間和環境因素)，RIRI組和給藥組均再分7個亞組，分別為再灌注后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d。排除標準：未到達預定時間死亡及造模失敗、有嚴重手術并發癥的白兔。將丁苯酞軟膠囊用食用麻油稀釋到10 mg/mL。治療組于造模成功后開始灌胃給藥，給藥劑量為40 mg/kg，每日1次，直至處死。對照組和RIRI組每日給予相同體積食用麻油灌胃。

1.5 標本的制備將實驗動物按照規定時間于耳緣靜脈過量麻醉處死后摘取眼球，快速置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h以上。將眼球壁自視乳頭處縱行剪開，在平行、垂直于視神經平面各取一塊約1 cm×0.5 cm視網膜組織置于包埋盒中，經過水洗、脫水、透明、石蠟包埋、切片，分別行HE染色、免疫組化法檢測B細胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)、抑癌基因(P53)表達量及TUNEL檢測細胞凋亡。

1.6 結果的判讀封片后，每張切片隨機取4個面積為0.2 mm×0.2 mm的高倍鏡視野(400×)觀察組織形態變化，應用計算機輔助圖像分析技術系統分析，計數各組陽性細胞數，計算平均值。

2 結果

2.1 光學顯微鏡下觀察視網膜組織形態變化對照組兔視網膜組織結構與人相似。RIRI組1 h視網膜神經纖維層及內叢狀層組織出現輕度水腫，厚度增加，染色較淡；6～24 h三個時間點，組織水腫逐漸加劇，其中神經纖維層和內叢狀層最明顯，可見RGCs排列稀疏；24 h視網膜內界膜不平滑,全層均可見高度水腫，神經纖維層明顯薄變，內核層細胞雜亂排列，RGCs數量大幅減少，細胞變性，邊界不清(圖1)。48 h、72 h各層組織水腫明顯減輕；120 h、7 d，視網膜水腫大幅消退，內層明顯萎縮，RGCs數量減少且稀疏排列。給藥組視網膜缺血再灌注后視網膜組織形態變化與RIRI組相比均較后者輕，可見丁苯酞能明顯的減輕缺血再灌注后視網膜組織的損傷。

2.2 Bcl-2和P53蛋白的表達

2.2.1Bcl-2的表達 Bcl-2具有抑制凋亡的作用，其陽性表達為細胞質的棕黃色染色。本實驗中對照組檢測到極少陽性染色細胞，兩個時間點無明顯差異，而RIRI組兩時間點與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，提示RIRI可以使Bcl-2表達增加(表1)。RIRI組在缺血再灌注后1 h時可見極少數陽性表達；6 h、12 h神經節細胞層陽性表達逐漸增多；24 h陽性表達到達高峰，除神經節細胞層外，內核層也可見陽性表達，外核層及色素上皮層未見陽性表達(圖2)；48 h、72 h可見神經節細胞層陽性表達逐漸下降，至7 d時已幾乎無陽性細胞表達。給藥組Bcl-2表達變化趨勢同RIRI組相似，但各個時間點表達強度較RIRI組明顯增強(7 d除外)，同RIRI組各時段相比較差異有統計學意義(表2)。

表1 RIRI組和對照組Bcl-2在再灌注后6 h、24 h陽性細胞數/(n=5，個/平方毫米，

表2 RIRI組和給藥組Bcl-2再灌注后各時間段陽性細胞數/(n=5，個/平方毫米，

注：1.a組內1 h與6 h比,P<0.01；2.b組內12 h與6 h比,P<0.01；3.c組內24 h與12 h比,P<0.01；4.d組內48 h與24 h比,P<0.01；5.e組內72 h與48 h比,P<0.01；6.f組內7 d與72 h比,P<0.01

2.2.2P53的表達 p53能通過下調Bcl-2基因表達而產生促節細胞凋亡作用，其陽性表達為細胞核質的棕色或淺棕色染色。對照組神經節細胞檢測到極少陽性表達，兩個時間點無明顯差異，而RIRI組兩時間點與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，提示RIRI可以使P53表達增加(表3)。RIRI組在缺血再灌注后1 h時可見極少數陽性表達；6 h、12 h神經節細胞層可見陽性表達逐漸增多；24 h陽性表達到達高峰，除神經節細胞層外，內核層也可見陽性表達，外核層及色素上皮層未見陽性表達(圖3)；48 h、72 h可見神經節細胞層陽性表達逐漸下降，至7 d時陽性細胞表達較少。給藥組P53表達變化趨勢同RIRI組相似,但各時間點表達強度明顯減弱,同RIRI組各時段相比較差異有統計學意義(表4)。

2.3 TUNEL法檢測細胞凋亡凋亡陽性細胞表達于細胞核，顏色為棕黃色。對照組可見極少凋亡陽性細胞，兩個時間點無明顯差異，而RIRI組兩時間點與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01),提示RIRI可以使凋亡增加(表5)。RIRI組再灌注后1 h神經節細胞層已經出現少量凋亡陽性表達；24 h前陽性表達呈上升趨勢，24 h陽性表達出現峰值(除神經節細胞層外，內核層、外核層也可見陽性細胞)(圖4)；48 h、72 h凋亡細胞數目呈下降趨勢；7 d時可見視網膜凋亡陽性細胞數極少，細胞核大量丟失。給藥組凋亡細胞表達變化趨勢同RIRI組，但各時間點表達強度明顯減弱(7 d除外)，同RIRI組各時段相比較差異有統計學意義(表6)。

表3 RIRI組和對照組P53在再灌注后6 h/24 h陽性細胞數/(n=5，個/平方毫米，

表4 RIRI組和給藥組P53再灌注后各時間段陽性細胞數/(n=5，個/平方毫米,

注：a組內1 h與6 h比,P<0.01；b組內12 h與6 h比,P<0.01；c組內24 h與12 h比,P<0.01；d組內48 h與24 h比,P<0.01；e組內72 h與48 h比,P<0.01；f組內7 d與72 h比,P<0.01

表5 RIRI組和對照組在再灌注后6 h、24 h凋亡陽性細胞數/(n=5，個/平方毫米，

3 討論

丁苯酞化學名稱為消旋-3-正丁基苯酞(dl-3n-butylphthalide)，是我國近年自主研發的一類新藥。既往大量的實驗研究及臨床觀察證實了丁苯酞在人體內靶點眾多，能廣泛分布于胃、腸、腦、脂肪等器官，直接透過血-腦屏障，能作用于心腦缺血疾病的多個病理環節，對腦缺血性疾病、血栓形成、血小板聚集、甚至急性缺血性腦卒中等疾病起到明顯改善作用，不僅能改善線粒體功能，還對腦部缺血區域的血流量、微循環、清除自由基和腦部功能代謝均起到改善作用，促進功能恢復的同時無明顯不良反應及毒副作用[5-10]。Xu等[11]實驗研究證實了丁苯酞對腦組織缺血性神經損傷有很強的保護作用，可最大程度恢復神經功能。有學者[12-13]研究丁苯酞對凋亡相關因子的影響的實驗結果表明丁苯酞對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，其機制可能與上調Bcl-2的表達、下調Bax的表達有關。袁曉勇[14]通過研究家兔體內丁苯酞藥動學發現其口服給藥吸收迅速，30 min即可達最大血藥濃度，且能迅速消除。雖然口服給藥生物利用度較低，但大量實驗研究表明口服給藥方式在體內諸多器官廣泛分布，以腦組織為主要靶器官，能起到有效的抑制細胞凋亡、減輕神經損傷的作用。本次實驗也表明了丁苯酞對RCGs的凋亡具有較好的保護作用。

表6 RIRI組和給藥組再灌注后各時間段凋亡陽性細胞數/(n=5，個/平方毫米，

注：1.a組內1 h與6 h比，P<0.01；2.b組內12 h與6 h比，P<0.01；3.c組內24 h與12 h比，P<0.01；4.d組內48 h與24 h比，P<0.01；5.e組內72 h與48 h比，P<0.01；6.f組內7 d與72 h比，P<0.01

細胞凋亡的發生由凋亡基因來進行調控，從一些早期的研究我們可以得知在視網膜缺血再灌注模型中，凋亡細胞存在于視網膜的神經節細胞層以及內核層[15]。任玉偉和宿華威[16]的實驗研究表明Bcl-2蛋白具有抑制細胞凋亡作用，而P53則作為調控Bax/Bak的上游調控機制誘導細胞凋亡[17]。本次實驗通過等劑量的丁苯酞與食用麻油灌胃給藥，可見在缺血再灌注損傷后1～24 h Bcl-2/P53表達均明顯增加，24 h達到高峰，24 h后則表達逐漸降低，差異有統計學意義。在給藥組中我們可以見到Bcl-2的表達均比同一時間點的RIRI組增強，差異有統計意義(7 d組除外)；P53的表達給藥組均低于同一時間點的RIRI組，差異有統計意義，證明了丁苯酞可以通過上調Bcl-2和下調P53的表達起到抑制細胞凋亡的作用。而TUNEL試驗中給藥組各時間點凋亡細胞數均小于RIRI組，差異有統計學意義(7 d組除外)，也同樣證實了丁苯酞對視網膜缺血再灌注損傷中細胞凋亡起到了保護作用。本實驗中7 d時凋亡和Bcl-2蛋白的陽性表達的組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，可能是與在7 d時觀察時間過長，RIRI對視網膜的損傷逐漸減輕及視網膜自身修復作用逐漸加強有關。

從本次實驗結果整體來看可以得出，丁苯酞能上調Bcl-2和下調P53的表達，減少凋亡細胞的表達數目，對RIRI后的細胞凋亡起到了一定的保護作用，提示丁苯酞可以透過血-視網膜屏障。但并未能完全避免凋亡的發生，可能的原因為一旦凋亡機制啟動，凋亡的發生可能是無法避免的。本次實驗沒有給予不同濃度的劑量，故不同藥物濃度對RIRI的影響有待進一步深入研究。

(本文圖1～4見插圖7-1)