熒光染色法和KOH濕片法檢測淺部真菌感染的效果比較

余菁 許輝 劉芝翠 馬越娥 史玉玲

同濟大學附屬第十人民醫院皮膚科，上海 200072

在常規的真菌直接鏡檢中，最常用的浮載液是10%～20%KOH，但因其背景雜亂，菌絲及孢子與脂滴、氣泡、雜質等不易分辨，當菌量較少或只有少量孢子時，容易漏診。熒光染色法用于真菌檢測時，染料能與真菌細胞壁的纖維素和幾丁質特異性結合而使菌體著色，真菌（菌絲和孢子）在鏡下為清晰的亮藍色，而組織呈淡藍色，背景為暗色，菌絲的橫隔結構和孢子的出芽形態清晰可見，易于識別。本研究收集600 例臨床擬診為淺部真菌感染、102例擬診為馬拉色菌感染的病例，通過對比熒光染色法和KOH 濕片法檢出陽性率和閱片時間，驗證熒光染色法診斷淺部真菌感染的優越性。

材料與方法

1.標本來源：2017年7月至2018年2月期間到同濟大學附屬第十人民醫院皮膚科就診、臨床擬診為真菌感染的淺部真菌病患者600例，其中擬診為手癬 47 例，足癬 146 例，體股癬 212 例，甲真菌病187 例。另收集擬診為馬拉色菌感染患者102 例，包括花斑糠疹54 例，馬拉色菌毛囊炎48 例。見表1。

2.試劑與儀器：熒光染色液（包含熒光素、KOH、復染劑，江蘇萊芙時代生物科技公司）；10%KOH 溶液自配；奧林巴斯CX21 顯微鏡（增加熒光模塊，日本奧林巴斯公司）；沙氏培養基（?？岂R嘉微生物技術有限公司）。

表1 600例擬診手足癬、體股癬、甲真菌病及102例擬診馬拉色菌感染患者標本真菌檢測陽性率比較［陽性例數（%）］

3.標本采集：①毛發標本采集：選擇8 例病損處、毛囊口折斷的毛發，用鑷子將毛發從頭皮拔出，盡量保留毛根部；②皮屑標本采集：鈍刀片刮取皮損炎性活動性邊緣的鱗屑；③甲標本采集：鈍刀從甲變色、萎縮或變脆的部位、健甲與病甲的交界處取材，保證一定深度，最好能達到甲板腹側；④毛囊炎標本采集：用無菌鈍刀的尖端挑破膿皰頂端，向內擠壓取出毛囊內乳酪狀內容物，將標本置于載玻片上。

4.直接鏡檢及培養：將同一患者同一部位取得的標本隨機分為3份，其中2份分別用KOH濕片法和熒光染色法由同一檢測員進行直接鏡檢，以高倍鏡下觀察到菌絲或孢子判定為陽性，開始觀察時計時，記錄閱片時間（鏡檢陰性不計時）。將另1份標本接種在沙堡弱培養基25 ℃培養2周，根據形態學及生化反應鑒定有無真菌生長及菌種（馬拉色菌標本不進行培養）。

5.熒光染色法與KOH 濕片法檢測：對600 例擬診為淺部真菌感染標本及按其來源（皮屑、甲、毛發），分別比較其檢出陽性率及平均閱片時間。對擬診為馬拉色菌感染的54 例花斑糠疹標本，48 例馬拉色菌毛囊炎標本分別比較兩種方法檢出陽性率及平均閱片時間。以培養為金標準比較兩種方法的漏診情況。

6.統計學分析：采用SPSS 20.0統計軟件，對于計數資料，理論數≥5 且總樣本量≥40 時采用卡方檢驗；1 ≤理論數＜5且總樣本量≥40時采用連續性校正的卡方檢驗；理論數＜1或總樣本量＜40時采用Fisher精確檢驗。計量資料采用±s表示，兩樣本均數比較采用配對設計t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.鏡下表現：熒光染色后，真菌（菌絲和孢子）被熒光標記，在鏡下可見亮藍色真菌輪廓（圖1）。而KOH 濕片法鏡下背景雜亂，菌絲及孢子呈無色透明或淡綠色折光，與背景反差小，與脂滴、氣泡、雜質等不易分辨，馬拉色菌毛囊炎標本還可見大量脂滴與孢子混雜，不易辨別（圖1）。

2.兩種方法檢測淺部真菌的陽性率：600 份標本中，熒光染色法與KOH 濕片法檢出陽性分別為546份（91.00%）、489份（81.50%），陽性率差異有統計學意義（χ2= 22.83，P＜ 0.05）。其中，皮屑標本405份，熒光染色法和KOH濕片法檢出陽性數分別為380份（93.83%）、348份（85.93%），陽性率差異有統計學意義（χ2= 13.89，P＜ 0.05）；甲標本187 份，檢出陽性數分別為 159 份（85.03%）、136 份（72.73%），差異有統計學意義（χ2= 8.49，P＜0.05）。毛發標本8份，分別檢出7份和5份陽性，差異無統計學意義（P=0.57）。

圖1 淺部真菌感染患者標本熒光染色法和KOH 濕片法檢測的效果比較 熒光染色后，真菌菌絲和孢子被熒光標記，見亮藍色真菌輪廓。而KOH濕片法鏡下背景雜亂，菌絲及孢子呈無色透明或淡綠色折光，與背景反差小，與脂滴、氣泡、雜質等不易分辨；馬拉色菌毛囊炎標本還可見大量脂滴與孢子混雜

3.兩種方法檢測皮屑來源標本的陽性率比較：405例皮屑標本，主要來源于臨床擬診為手足癬和體股癬患者。手癬47 例，熒光染色法和KOH 濕片法陽性率分別為87.23%、70.21%，差異有統計學意義（P＜0.05）。足癬146例，陽性率分別為92.47%、82.19%，差異有統計學意義（P＜0.05）。體股癬212例，陽性率分別為96.23%、91.98%，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表1。

4.兩種方法檢測甲來源標本的陽性率比較：熒光染色法和KOH濕片法檢測甲標本187例，遠端側位甲下型69 例，陽性率分別為86.96%、71.01%（P＜ 0.05）；近端甲下型 24 例，陽性率分別為58.33%、50.00%（P＞ 0.05），全甲毀損型51例，檢出陽性率分別為88.24%、70.59%（P＜ 0.05）；白色淺表型 43 例，陽性率分別為 93.02%、90.70%（P＞0.05）。見表1。

5.兩種方法檢測馬拉色菌感染標本的陽性率比較：102 例擬診為馬拉色菌感染患者的標本中，熒光染色法與KOH 濕片法的檢測陽性率分別為92.16%、59.80%（P＜ 0.05），對花斑糠疹的檢出陽性率差異無統計學意義（P＞0.05），對馬拉色菌毛囊炎標本檢出陽性率差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

6.兩種檢測方法閱片時間比較：600 份淺部真菌標本，熒光染色法與KOH 濕片法閱片時間分別為（73.67 ± 13.56）s、（87.12 ± 15.83）s（t= 14.60，P＜ 0.05）。54 份花斑糠疹標本分別為（38.36 ±8.79）s、（41.25 ± 15.67）s（t= 1.14，P＞ 0.05）。48份馬拉色菌毛囊炎標本分別為（42.14 ± 12.61）s、（103.56 ± 9.48）s（t=17.83，P＜ 0.05）。

7.培養結果及兩種方法漏診的比較：在600例標本中，479 例培養陽性，手癬 37 例，足癬 114 例，體股癬198例，甲真菌病127例，毛發3例。檢出菌種包括紅色毛癬菌302 例、犬小孢子菌43 例、石膏樣小孢子菌32例、須癬毛癬菌36例、絮狀表皮癬菌13例、白念珠菌52例、斷發毛癬菌1例。培養陽性的479 例中，熒光染色法陽性476 例，陰性3 例（0.63%）；KOH 濕片法陽性 465 例，陰性 14 例（2.92%），兩種方法檢測漏診率差異有統計學意義（χ2=7.25，P＜ 0.05）。熒光染色法靈敏度99.37%，特異度42.15%；KOH濕片法靈敏度97.28%，特異度80.17%。見表2。

表2 600例淺部真菌感染患者培養結果及熒光染色法和KOH濕片法檢測效果比較（例）

討 論

淺部真菌病是各類感染性皮膚病中常見病和多發病。直接鏡檢法是淺部真菌形態學檢查的基本方法［1］。KOH 濕片法是臨床上直接鏡檢使用最早、最廣的方法，該法操作簡單、快捷，不需要特殊儀器。但缺點亦明顯，例如背景雜亂、檢出率偏低，該缺點在檢測甲標本、馬拉色菌毛囊炎尤為明顯，且孢子類結構易與氣泡、脂滴混淆。熒光染色液是一種高純度熒光素和特定比例KOH 的復合溶液，熒光素標記的幾丁質重組酶能與真菌細胞壁中的幾丁質特異性結合，形成強熒光復合物，使真菌結構發出亮藍色的熒光。該方法容易掌握，操作方法與KOH 濕片法一致，且無需加熱，耗時短，結果直觀，同時也彌補了KOH濕片法對疑難標本（菌量少的標本、材質厚的甲屑標本、僅有孢子的標本、外涂藥膏的標本等）易出現假陰性的缺點。特別是對于馬拉色菌毛囊炎標本，熒光染色法不標記脂滴，易于分辨脂滴和孢子。值得注意的是，熒光染色法也能標記植物纖維素，空氣和玻片上存在的少量纖維，在熒光顯微鏡下也可發出熒光，但纖維形態一般不規則，大小、粗細、亮度等都與真菌有很大差異，沒有典型的真菌橫隔和出芽結構，憑經驗一般可以避免假陽性情況的發生。［2-5］

我們通過對比熒光染色法和KOH濕片法檢測門診收集的擬診為淺部真菌感染標本的檢出陽性率，發現熒光染色法陽性率明顯高于KOH濕片法，且閱片時間明顯低于KOH濕片法。根據標本來源細分，皮屑、甲標本熒光染色的陽性率均高于KOH法，研究結果與既往類似報道一致［6-8］。兩種方法對毛發標本的檢出率差異無統計學意義，但由于毛發標本僅8例，可能會影響統計結果。

本研究皮屑標本主要來自擬診為體股癬和手足癬的患者，兩種方法對來自體股癬皮屑檢出陽性率差異無統計學意義，由于體股癬患者皮屑角質較薄，雜質較少，鏡下菌絲在KOH 濕片中也較易辨認。兩種方法對手癬水皰鱗屑型檢出陽性率差異無統計學意義，而角化增厚型檢出陽性率有明顯差異，對足癬角化過度型檢出陽性率有明顯差異。當皮屑角質較厚時，KOH不易溶解角質使之透明，組織與真菌不易分離，檢出較困難，且角化型手足癬一般出現濕疹化，皮屑中菌量較少，容易遺漏，而熒光染色標本對比明顯，不易漏診。

對于甲來源標本，兩種方法對遠端側位甲下型和全甲毀損型檢出陽性率有明顯差異，而近端甲下型和白色淺表型檢出陽性率差異無統計學意義?？紤]近端側位甲下型因其病變在甲下，用鈍刀刮取時不易取到病變部位甲屑，使兩種方法陽性率均偏低。胡記妹等［9］發現用浸軟法可提高甲標本鏡檢陽性率。白色淺表型因病變部位較淺，刮取的標本一般菌量較多、雜質較少，兩種方法陽性率均較高。而遠端側位甲下型和全甲毀損型指（趾）甲增厚，KOH不易溶解，呈灰黃或灰褐色，雜質較多，鏡下雜亂，不易分辨，而熒光染色法鏡下除真菌為亮藍色，組織細胞為淡藍色，其他雜質均不染色，能明顯提高檢出陽性率。已有文獻報道熒光染色法在甲真菌病檢測中的應用價值［10-11］。

馬拉色菌主要定植于頭、面、頸、肩、胸、背等部位，是一種嗜脂性酵母菌，與多種皮膚疾病如花斑糠疹、馬拉色菌毛囊炎、特應性皮炎、脂溢性皮炎、銀屑病等有關［12］。本研究兩種方法對馬拉色菌檢出陽性率分別為92.16%、59.80%，高于派克墨水（84.44%）［13］和芝加哥天藍（68.68%）［14］，但由于標本選擇和操作人員不同，熒光染色和其他染色方法的對比還有待進一步研究。我們采用兩種方法檢測花斑糠疹標本的陽性率和閱片時間結果無顯著性差異，而馬拉色菌毛囊炎有顯著差異?？紤]主要是由于花斑糠疹患者選取典型病例，鏡下呈葡萄狀分布的圓形、卵圓形孢子和短粗、兩頭鈍圓的臘腸形菌絲的典型形態特征在KOH 涂片中也清晰易辨，而只表現為孢子形態的馬拉色菌毛囊炎采用KOH 法鏡檢時，其孢子混于角栓之中，易與散在、圓形、暗綠色、反光的脂肪滴混淆，很難準確查出陽性孢子，而用熒光染色后孢子呈亮藍色，脂滴、氣泡均不著色，對比明顯，可提高馬拉色菌檢出的準確性和速度。Ramos 等［15］也發現熒光增白劑能提高馬拉色菌鏡檢陽性率。

綜上所述，對于淺部真菌感染的直接鏡檢，熒光染色法檢出陽性率和閱片時間均優于KOH濕片法，特別是對于角質較厚、菌量較少、僅有孢子或雜質較多的標本，熒光染色法更快速、簡便，陽性率更高，漏診更少。

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