gata3基因表達與人乳腺腫瘤病理特征的相關性分析

錢衛東, 沈蘭芳, 王 婷*, 劉翌超, 石 麗, 李永東

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021； 2.寧波疾病預防控制中心，浙江 寧波 315000)

0 引言

根據美國癌癥學會的《2018年全球腫瘤統計數據報告》，2018年全球新發乳腺癌病例208.88萬人，死亡62.67萬人.在中國，女性乳腺癌的乳腺癌發病率、死亡率逐年上升，且逐年趨于年輕化.乳腺癌正成為危害女性健康，影響女性生活質量的最大威脅[1,2].

GATA 連接蛋白3(GATA bingding protein 3，GATA3)，屬于GATA轉錄因子家族，可以作為雌激素受體α(Estrogen receptorα，ERα)調控靶基因的轉錄必需共調節因子(Co-activator和Co-repressor)調控細胞的PR、pS2、c-fos、C-Mye、cathepsinD、cyclin-Dl和bcl-2等基因的表達，進而調控細胞的增殖和凋亡，調節乳腺導管上皮細胞的遺傳分化方向，GATA3的缺失可能與ER-乳腺癌的發生有關，其基因組的多態性及表達的改變會影響乳腺癌的發生發展以及預后[3,4].

Jacquemier J等[5]分析了240例接受激素治療的ER+乳腺癌患者中GATA3 、Ki67、P53表達與預后效果之間的關聯性，結果發現GATA3、Ki67和P53表達水平與接受激素治療的ER陽性乳腺癌患者的預后顯著相關.Mehta R J等[6]發現，GATA3高表達的Luminal型乳腺癌，預后良好，GATA3低表達的浸潤性癌預后不良.說明GATA3可以作為備選的腫瘤標志輔助判斷乳腺癌的發展及預后.但是GATA3表達與中國女性乳腺癌患者病理特征和預后關系尚不明確，并且傳統的免疫組織化學染色方法檢測GATA3表達，操作繁瑣、周期漫長且易出現假陽性結果，亟需建立快速準確地GATA3臨床檢測方法，輔助乳腺癌的精準診斷和預后評估.

因此，本研究運用靈敏度高、特異性好及高通量的Taqman探針一步法實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測乳腺腫瘤組織中gata3基因的表達情況，分析其GATA3表達與乳腺癌分子分型及臨床病理特征的相關性，為乳腺癌患者的診斷及預后評估提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MCF7購自中國科學院上海細胞工程中心；小鼠抗人GATA3抗體、小鼠抗人β-actin抗體和HRP標記的山羊抗小鼠抗體均購自北京中杉金橋公司；乳腺冰凍組織樣采集自于西安交通大學第一附屬醫院.

1.2 試劑

一步法實時熒光定量反轉錄PCR試劑盒(Takara)、TRIzol 試劑(Invitrogen)、DMEM培養基(HyClone)和胰蛋白酶(HyClone)、其他試劑均為國產分析純.

1.3 儀器

二氧化碳培養箱(美國Heraeus)、實時熒光定量PCR儀(ABI PRISM7500)、Nano Drop 2000C 超微量分光光度計(美國Thermo)等.

1.4 方法

1.4.1 細胞系培養及其總RNA的提取

將人乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MCF7分別置于含10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素的高糖DMEM培養液中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的CO2培養箱中培養至對數生長期，用預冷的PBS洗滌3次，按照Trizol試劑說明書提取細胞總RNA，并用Nano Drop2000C超微量分光光度計檢測總RNA濃度和純度，-80 ℃凍存.

1.4.2 gata3基因和內參actb基因引物和探針的設計與合成

選用肌動蛋白(β-actin，actb)為內參基因，從Genebank中下載人源 gata3基因和actb基因的mRNA序列，利用Primer Express 3.0設計引物和探針，設計的備選引物及探針序列用NCBI(National Center for Biotechnology Information)數據庫中的Primer Blast進行特異性的檢查，送上海生工有限公司合成.具體序列如表1所示.

表1 gata3基因的引物和探針序列

1.4.3 gata3基因和內參actb基因標準曲線的制作

將細胞系總RNA稀釋至100μg/μL，進行10倍比梯度稀釋，使終濃度依次為100μg/μL、10μg/μL、1μg/μL、10-1μg/μL和10-2μg/μL.按照一步法RT-PCR試劑盒(Takara)的說明書，冰盒上配制PCR反應的體系：10μL 2×RT-PCR緩沖液，0.4μL 反轉錄酶，0.4μL Ex Taq HS酶(5 U/μL)，0.4μL PCR上游引物(10μM)，0.4μL PCR下游引物(10μM)，0.3μL TaqMan探針(10μM)，1μL模板RNA，補充無RNA酶水至20μL.反應體系置于ABI PRISM7500上運行，程序為42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，反轉錄-95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40個循環的擴增反應.擴增結束后用Real Time PCR 軟件對擴增結果進行分析，利用(1+E)-ΔCt法(ΔCt = Ctgata3-Ctactb)計算樣本中gata3基因mRNA的相對表達量.若gata3基因與actb基因引物的擴增效率均接近100%，則直接用2-ΔCt計算樣本gata3基因相對表達量.

1.4.4 乳腺癌細胞系GATA3表達的Western blot檢測

參照Voduc等的方法[7,8]提取MDA-MB-231，MCF7細胞的蛋白，并用Nano Drop2000C檢測蛋白濃度；稀釋蛋白質至約50μg，取20μL樣品加入5μL 5×SDS 上樣緩沖液，100 ℃變性5 min；離心取上清，以4%的濃縮膠，10%分離膠進行SDS-PAGE電泳(100 V，恒壓電泳2～3 h)；冰浴內100 V恒壓轉PVDF膜1 h；5%脫脂奶粉室溫封閉；加入小鼠抗人GATA3的特異性一抗室溫2 h，1×TBST洗膜3次；再加入HRP標記的羊抗小鼠IgG，室溫1 h，洗膜3次；用ECL發光液均勻覆蓋轉印的PVDF膜上，將膜置于分光成像儀中成像，用凝膠圖象處理系統記錄分析目標條帶的表達.

1.4.5 gata3基因在臨床乳腺腫瘤樣本中mRNA表達檢測

收集2013～2014年西安交通大學第一附屬醫院乳腺腫瘤冰凍組織樣本100例，良性乳腺病變組織30例(15例乳腺增生、15例乳腺纖維腺瘤)，以及癌旁瘤旁組織45例.其中87例浸潤性導管癌患者均按照2011年St.Gallen國際乳腺癌大會乳腺癌分子分型標準分型，由兩位資深病理醫師復核切片，明確診斷，并通過查閱電子病歷統計整理病人信息.冰凍的乳腺組織樣本，采取約5 mm3，用一次性手術刀快速切碎，移入預冷的研缽中，加液氮研磨組織至粉狀，參考1.4.1方法提取樣本總RNA，按照1.4.3方法檢測腫瘤組織樣本中gata3基因的表達情況.

1.4.6 數據分析

利用SPSS 19.0對乳腺腫瘤組織中gata3基因表達進行非參數Mann-Whitney檢驗(雙變量)或Kruskall-Wallis檢驗(多變量)，以p<0.05計為差異有統計學意義，分析gata3基因表達水平與乳腺腫瘤病理參數的相關性.

2 結果與討論

2.1 引物探針檢測準確性及特異性

分別配制gata3、actb基因的擴增體系，對MDA-MB-231、MCF7細胞系總RNA進行檢測，結果顯示，ER+的MCF7細胞gata3基因mRNA的相對表達量顯著高于ER-的MDA-MB-231細胞(1.41E-01 Vs 1.66E-04)，而空白對照(NTC)未出現非特異曲線，vk如圖1(a)所示.Western blot結果如圖1(b)所示，MCF-7細胞中的GATA3在相應的位置(56KDa)出現了明顯的條帶，而MDA-MB-231細胞中無可見條帶.qRT-PCR的檢測結果與GATA3蛋白的表達量相符合，證實設計的引物和探針檢測準確性及特異性良好.

(a)gata3基因表達的qRT-PCR結果

(b)GATA3表達Western blot結果圖1 人乳腺癌細胞系中gata3基因的表達

2.2 gata3基因qRT-PCR的標準曲線

以10倍比梯度稀釋的MDA-MB-231、MCF7細胞株總RNA為模板進行qRT-PCR，結果如圖2(a)所示，gata3基因標準曲線呈現良好的線性梯度，擴增斜率(Slope)為-3.335相關系數(R2)為0.998，擴增效率(Eff%)為99.449 %，可用2-ΔCt相對定量法分析目的基因mRNA的相對表達水平，并進一步證實了設計的引物及探針具有良好的特異性.

(c)actb基因的qRT-PCR擴增曲線

(d)actb基因qRT-PCR的標準曲線圖2 gata3基因和actb基因qRT-PCR擴增的標準曲線

2.3 gata3基因mRNA異常低表達與乳腺腫瘤的發生、轉移及不良預后正相關

2.3.1 gata3基因mRNA異常低表達與乳腺腫瘤的發生正相關

以2.2建立的qRT-PCR方法對收集到的100例乳腺腫瘤冰凍組織樣本進行檢測，結果表明gata3基因mRNA在瘤旁組織中的表達率高于腫瘤組織(9.1392E-02 Vs 5.0548E-02，p=0.007 1)，如圖3(a)所示；gata3基因mRNA在惡性腫瘤浸潤性導管癌、浸潤性小葉癌、髓樣癌相對表達量分別為4.73E-02、2.52E-03、2.41E-02，在良性纖維腺瘤中表達量為6.87E-02，顯著高于惡性瘤組織(p=0.002，如圖3(b)所示).提示gata3基因mRNA異常低表達可能促進乳腺腫瘤的發生.

2.3.2 gata3基因mRNA異常低表達與ER+乳腺癌的發展轉移正相關

實驗對87例乳腺浸潤性導管癌樣本進行了分析，發現gata3基因在不同TNM分期，不同分化等級組織中mRNA表達無顯著差異(如表2所示).然而在66例ER+的乳腺浸潤性導管癌樣本中，gata3基因mRNA的表達在腫瘤體積較大(5.74E-02)，發生淋巴結轉移(5.10E-02)、TNM分期較高(5.03E-02)、分化級別高(5.26E-02)的癌組織中顯著低于腫瘤體積小(7.86E-02)，無淋巴結轉移(8.13E-02)、TNM分期低(6.80E-02)、分化級別低(6.80E-02)的癌組織(p腫瘤大小=0.032；p淋巴結轉移=0.000 2；pTNM分期=0.021 5；p分化=0.028 7)(如圖3(c)、(d)和表3所示).表明，gata3基因mRNA異常低表達可能促進ER+的乳腺浸潤性導管癌進一步發展、轉移.

2.3.3 gata3基因mRNA表達與乳腺浸潤性導管癌Luminal分型正相關

在87例乳腺浸潤性導管癌組織分析中，gata3基因在ER+的Luminal A、Luminal B(HER2+)、Luminal B(HER2-)亞型中mRNA的相對表達量分別為6.53E-02、5.74E-02、5.51E-02，顯著高于ER-的HER2過表達型(8.47E-03)和三陰型(4.83E-03)乳腺癌(p=0.000 1).Cakir A等[9]認為GATA3是乳腺中Luminal細胞分化所必需轉錄因子，GATA3表達與乳腺癌雌激素受體(ER)表達呈正相關，并且與患者的預后相關，而ER是臨床乳腺癌診斷和治療的重要生化標志，大約65%的乳腺癌呈ER+，ER+的乳腺癌患者其組織分化程度高，侵襲性不強，內分泌治療能夠有效的抑制E2誘導的增殖，預后較好.與之相反，GATA3-，ER-乳腺癌通常是低分化的，內分泌治療耐受，侵襲性更強，預后較差，尤其三陰型乳腺癌對常規化療藥物不敏感，沒有特異性靶向藥物，疾病進展快，死亡率較高[10-12]，gata3基因mRNA的表達與ER的表達和乳腺癌Luminal亞型顯著正相關(rER表型=0.512***，r分型=0.459***，如圖3(e)、(f)所示).

(a)組織來源 (b)病理組織分型 (c)TNM分期

(d)腫瘤分化級別 (e)分子分型 (f)ER表型IDC：浸潤性導管癌；FIB：纖維腺瘤；MED： 髓樣癌 ； ILC：浸潤性小葉癌;HYP：乳腺增生圖3 gata3基因mRNA的表達與乳腺腫瘤臨床病理特征相關性

3 結論

GATA3屬于GATA轉錄因子家族，在多種組織中均有表達，在CD4+T細胞分化發育過程中發揮重要作用.同時，GATA3是雌激素受體α(ERα)復合體中的關鍵分子，可協助實現ER活化，參與激活下游Ras-Raf-MEK-MAPK、 Src-PI3K-Akt-eNOS信號通路，進而調控細胞的增殖和凋亡，調節乳腺導管上皮細胞的遺傳分化方向.

目前，發達國家對GATA3與乳腺癌的臨床檢測研究相對比較詳盡.Ordez N G[13]與Clark B Z等[14]研究發現GATA3不僅與乳腺癌的預后有關，還可能作為乳腺腫瘤的鑒別診斷標記.因此可選擇GATA3來鑒別乳腺癌，尤其是在三陰性乳腺癌的ER的豐度及活性、藥物敏感性的鑒定[15].

研究結果表明gata3基因異常低表達可能促進乳腺腫瘤的發生.并可能促進ER+的乳腺浸潤性導管癌進一步發展、轉移.該結果與Asselin Labat M L等[16]的實驗結果相符合，證明本研究運用自主設計的引物和探針可用于臨床乳腺癌樣本gata3基因相對表達量快速檢測，對臨床浸潤性導管癌的診斷、用藥治療和預后判斷具有一定參考價值.