兩階段溶氧控制及FeSO4添加對谷氨酸棒桿菌合成4-羥基異亮氨酸的影響

孟靜，蘆楠，朱福周，董解榮，王子申，陳寧，張成林, 2 *

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457) 2(菱花集團有限公司，山東 濟寧，272073)

4-羥基異亮氨酸是L-異亮氨酸羥化物，具有血糖水平依賴的促進胰島素分泌的特性，同時還有保護肝功能、促進脂肪代謝等功能，對糖尿病、高血脂、肥胖等疾病具有良好的預防和治療效果，應用前景廣闊[1-6]。目前4-羥基異亮氨酸的工業化生產主要采用胡蘆巴種子提取法，但該方法存在原材料需求量大、分離純化困難、提取率低(0.091%～0.6%)、成本高等不足[7]。而化學法反應條件苛刻、步驟多、分離困難、收率低(21%～31%)而且容易引起環境污染，因此仍停留在研究階段[8-14]。KODERA等首次在蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis) 中發現能夠以L-異亮氨酸和α-酮戊二酸為底物、特異性催化生成4-羥基異亮氨酸的異亮氨酸羥化酶(isoleucine dioxygenase，IDO，由ido基因編碼)[9](圖1)。

圖1 異亮氨酸羥化酶催化生成4-羥異亮氨酸的反應示意圖[8]
Fig.1 Diagram of reaction for 4-hydroxyisoleucine synthesis catalized by IDO

溶氧是微生物發酵過程中的重要環境因素之一，在菌體生長、產物形成和維持細胞的代謝中起著重要的作用[17-20]。溶氧均對上述代謝途徑有一定影響。此外，Fe2+容易被氧化為Fe3+，在搖瓶發酵或者酶法合成4-羥基異亮氨酸時，通常添加還原性物質(如Vc)防止其氧化[21-22]，然而在大規模發酵過程中不易操作，故可通過控制溶氧或補充Fe2+來保持IDO活性。本文針對上述問題，在明晰了4-羥基異亮氨酸發酵過程中溶氧水平變化規律的基礎上優化了溶氧控制水平和Fe2+的添加濃度，從而實現了4-羥基異亮氨酸的高效合成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

4-羥基異亮氨酸生產菌株C.glutamicumHIL18，由本實驗室保藏[14]。

1.1.2 培養基

種子培養基(g/L)：葡萄糖 25，酵母粉 5，(NH4)2SO45，KH2PO4·3H2O 2，MnSO4·7H2O 0.06，玉米漿 40 mL，pH 7.0～7.5，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖100，(NH4)2SO43，KH2PO4·3H2O 0.5，MgSO4·7H2O 0.6，MnSO4·7H2O 0.015，FeSO4·7H2O 0.017，VB10.001，谷氨酸 3，酵母粉 0.5，玉米漿 34 mL，pH 7.0～7.5，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.3 儀器與設備

BIOTECH-5JG 5L發酵罐，上海保興生物設備工程有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；Thermo U3000高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵試驗

將活化后的C.glutamicumHIL18培養物以1%的接種量接種至含30 mL種子培養基，于32 ℃、220 r/min 振蕩培養10～12 h。將上述種子培養物以10%的接種量接種至含有3 L發酵培養基的5 L自動控制發酵罐中。發酵過程中控制溫度34 ℃、用氨水控制pH=7.0，通過控制通風量和攪拌轉速根據實驗要求調節溶氧水平，流加消泡劑消除泡沫?？疾?-羥基異亮氨酸發酵過程中溶氧水平的動態變化時，通氣量為3.5 L/min，攪拌轉速為400 r/min。分階段溶氧控制策略如表1所示。

表1 4-羥基異亮氨酸發酵過程中的兩階段溶氧控制策略Table 1 The two-stage DO control strategy during fermentation process of 4-hydroxyisoleucine

1.2.2 IDO酶活性測定

發酵過程中收集不同時間點發酵液，于4 ℃、8 000×g離心1 min后棄上清液。細胞重懸于10 mL Tris-HCl緩沖液(100 mmol/L，pH 7.0)，然后利用超聲破碎儀破碎。將上述破碎物于4 ℃、13 000×g離心30 min后取上清，然后利用濾柱(PD-10 除鹽柱，英國GE Healthcare公司)過濾除鹽。取濾液100 μL加入900 μL含10 mmol/L α-酮戊二酸和L-異亮氨酸、5 mmol/L FeSO4和 10 mmol/L抗壞血酸的Tris-HCl緩沖液(100 mmol/L，pH 7.0)，反應30 min后利用高效液相色譜儀測定4-羥基異亮氨酸濃度[14]，以每毫克總蛋白每分鐘催化生成的4-羥基異亮氨酸[nmol/(min·mg蛋白)]表示IDO的比活力。

1.2.3 氨基酸、葡萄糖及生物量檢測

發酵過程中收集不同時間點發酵液1 mL，于4 ℃、 8 000×g離心5 min后取上清液。經2, 4-二硝基氟苯衍生后利用高效液相色譜儀測定4-羥基異亮氨酸、L-異亮氨酸(Ile)、L-丙氨酸(Ala)、L-天冬氨酸(Asp)、L-亮氨酸(Leu)、L-纈氨酸(Val)和L-賴氨酸(Lys)，質量濃度。檢測條件為：ZORBAX Eclipse AAA氨基酸柱(美國Agilent公司)，乙腈(體積分數50%)/醋酸銨(50 mmol/L)二元梯度洗脫。采用SBA-40D生物傳感分析儀(山東省科學院生物研究所)多功能谷氨酸-葡萄糖分析儀測定殘糖量。發酵液經離心后，用生理鹽水洗滌菌體沉淀3次，然后用適量生理鹽水重懸。利用分光光度計測定其發酵液OD600，根據公式(1)計算菌體生物量：

細胞干重/(g·L-1)=0.242×OD600-0.016

(1)

2 結果與討論

2.1 溶氧水平對4-羥基異亮氨酸發酵的影響

4-羥基異亮氨酸的合成需要L-異亮氨酸和α-酮戊二酸，溶氧對這兩種前體物均有較大影響[23-24]，因此溶氧水平的控制對4-羥基異亮氨酸發酵具有至關重要的作用?？疾炝巳苎跛綄?-羥基異亮氨酸發酵的影響，結果如圖2和表2所示。

在不同溶氧水平條件下，菌株C.glutamicumHIL18的生長和產酸趨勢一致：發酵初期(0～20 h)生長速率較快，20 h后逐漸下降，但4-羥基異亮氨酸的合成速率和產量逐漸提升。當溶氧水平為20%時，生物量、4-羥基異亮氨酸產量及轉化率最高，分別為18.3 g/L、34.1 g/L和15.0%。當溶氧水平為30%時，發酵初期的生物量高于其余溶氧水平，但隨后生長速率迅速下降，其原因可能是盡管溶氧水平的升高提高了生長速率，但使得菌體細胞過早衰老，發酵終止時其生物量、4-羥基異亮氨酸產量分別為13.5 g/L和24.5 g/L，高于溶氧水平為10%；但其轉化率低于后者，其原因可能是由于葡萄糖的消耗除用于合成4-羥 基異亮氨酸外，更多用于菌體細胞生長和呼吸作用。溶氧水平為20%時，主要副產物L-天冬氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸和L-異亮氨酸均高于溶氧水平為10%；而溶氧水平為30%時，上述副產物最低。由此推測，適當的溶氧水平(20%)提高了TCA循環代謝流，從而為4-羥基異亮氨酸的合成提供更多的α-酮戊二酸；但當溶氧水平過高(30%)時，TCA循環代謝流進一步增強，使得L-異亮氨酸和α-酮戊二酸代謝不平衡，不利于4-羥基異亮氨酸的合成。

A-4-羥基異亮氨酸產量及生物量；B-氨基酸質量濃度圖2 溶氧水平對4-羥基異亮氨酸發酵的影響Fig.2 Effects of DO levels on 4-hydroxyisoleucine fermentation

表2 溶氧對4-羥基異亮氨酸發酵參數的影響Table 2 Effect of DO levels on parameters of 4-hydroxyisoleucine fermentation

2.2 4-羥基異亮氨酸發酵過程中溶氧水平的動態變化

IDO屬于Fe2+和α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶家族，故催化4-羥基異亮氨酸合成時需要O2[9, 25]。由圖2-A可知，C.glutamicumHIL18的最高生長速率和4-羥基異亮氨酸的最高合成速率分別于發酵初期和中期，可見4-羥基異亮氨酸的合成為非生長依賴型。綜上，推測在發酵過程中C.glutamicumHIL18對溶氧的需求會有所變化。因此考察了4-羥基異亮氨酸發酵過程中溶氧水平的動態變化，結果如圖3所示。溶氧水平于0～10 h迅速下降，于10～20 h緩慢下降，該階段以菌體生長為主，4-羥基異亮氨酸合成速率逐漸提高。溶氧于20～40 h再次快速下降，該階段菌體生長速率顯著下降，但4-羥基異亮氨酸合成速率和產量迅速提升。40 h后溶氧水平趨于穩定，菌體生長達到穩定期，4-羥基異亮氨酸合成量持續增加，但其合成速率顯著降低，其原因可能是過低的溶氧難以滿足4-羥基異亮氨酸合成的需求。由此可見，發酵中期及后期時，C.glutamicumHIL18對氧需求量進一步升高。發酵結束時，4-羥基異亮氨酸產量和菌體生物量分別達到15.7 g/L和15.4 g/L。

圖3 4-羥基異亮氨酸發酵過程中溶氧水平動態變化Fig.3 Dynamics of DO levels during 4-hydroxyisoleucine fermentation

2.3 兩階段溶氧控制對4-羥基異亮氨酸發酵的影響

2.3.1 兩階段溶氧水平優化

由圖3可知，4-羥基異亮氨酸發酵過程中對氧的需求不同，即發酵中期和后期(20～64 h)較發酵初期(0～20 h)需氧量高。因此，控制發酵過程中各階段的溶氧水平，可滿足C.glutamicumHIL18對氧的需求，并有望進一步提高4-羥基異亮氨酸的產量。結合結果2.1和2.2，提出4種分階段溶氧控制策略(表1)，并考察其對4-羥基異亮氨酸發酵的影響。結果如圖4和表3所示。

控制策略Ⅲ時，于發酵中期和后期4-羥基異亮氨酸的產酸速率高于其他策略，其終產量達到最高值38.7 g/L，其次依次為策略Ⅱ、Ⅰ和Ⅳ；然而控制策略Ⅳ條件下，生物量最高，為22.1 g/L，其次依次為策略Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ。此外，還可知溶氧控制策略Ⅲ條件下，葡萄糖消耗量(255.9 g/L)最大。由此可見，不同的溶氧控制策略導致菌體生物量和4-羥基異亮氨酸產量差異較大。發酵前期溶氧控制在20%、后期控制在30%時效果最佳。這可能與細胞實際需氧量吻合，即發酵初始階段，細胞生長所需溶氧相對少，4-羥基異亮

A-4-羥基異亮氨酸產量; B-生長曲線圖4 溶氧控制策略對4-羥基異亮氨酸發酵的影響Fig.4 Effects of DO control strategies on 4-hydroxyisoleucine fermentation

表3 溶氧控制策略對4-羥基異亮氨酸發酵參數的影響Table 3 Effects of DO control strategies on parameters of 4-hydroxyisoleucine fermentation

發酵參數溶氧控制策略ⅠⅡⅢⅣ4-羥基異亮氨酸產量/(g·L-1)34.836.138.730.5生物量/(g·L-1)18.018.520.222.1耗糖量/(g·L-1)230.5240.7255.9213.3轉化率/%15.115.015.114.3單位菌體產量/(g· g-1)1.92.01.91.4發酵強度/[g·(L·h)-1]0.50.60.60.5

氨酸合成代謝速率低，從而需要較低的氧氣供應；發酵中期和后期4-羥基異亮氨酸合成速率增加，故氧氣需求量提高。

2.3.2 溶氧轉變時間對4-羥基異亮氨酸發酵的影響

分別于16、18、20、22和24 h提高溶氧水平至30%，考察其對4-羥基異亮氨酸發酵的影響。結果如表4所示。

表4 溶氧轉變時間對4-羥基異亮氨酸發酵參數的影響Table 4 Effects of DO shift time on parameters of 4-hydroxyisoleucine fermentation

溶氧轉變時間為16、18和20 h時，4-羥基異亮氨酸產量依次升高， 20 h時其產量最高。溶氧轉變時間為22和24 h時，4-羥基異亮氨酸產量降低?？梢?，20 h時提高溶氧至30%最有利于4-羥基異亮氨酸的合成。

2.4 FeSO4添加工藝優化

2.4.1 FeSO4初始濃度對4-羥基異亮氨酸發酵的影響

如前所述，IDO在催化4-羥基異亮氨酸合成過程需要Fe2+，研究表明Fe2+濃度對其活性影響顯著[9，25-26]。Fe2+在發酵過程中容易被O2氧化，不利于IDO催化L-異亮氨酸合成4-羥基異亮氨酸?？疾炝薋eSO4初始濃度對4-羥基異亮氨酸發酵的影響，結果如表5所示。隨著FeSO4濃度的增加，4-羥基異亮氨酸的合成量提高，當其濃度為65 μmol/L時，4-羥基異亮氨酸的產量達到41.5 g/L，表明該條件下有利于IDO活性的保持。當FeSO4濃度高于65 μmol/L時，4-羥基異亮氨酸的產量不再提高。而FeSO4濃度對生物量無明顯影響。

表5 FeSO4初始濃度對4-羥基異亮氨酸發酵參數的影響Table 5 Effects of primary FeSO4 concentration on parameters of 4-hydroxyisoleucine fermentation

2.4.2 發酵過程中添加FeSO4對4-羥基異亮氨酸發酵的影響

由于在發酵20 h后溶氧水平提升，Fe2+可能易被O2氧化為Fe3+，不利于IDO活性的保持。檢測了發酵過程中IDO的活性，結果如圖5所示。

圖5 發酵過程中添加FeSO4對IDO活性的影響Fig.5 Effects of FeSO4 addition during fermentation process on IDO activity

隨著發酵時間的延長，IDO活性持續提高，但24 h 時IDO的活性降低，隨后劇烈降低，由此推測發酵20 h后，隨著溶氧水平的提升，部分Fe2+被氧化，致使IDO活性下降，影響4-羥基異亮氨酸的合成。因此考察了20 h添加不同濃度FeSO4對4-羥基異亮氨酸的影響。結果如表6所示，FeSO4添加量為10 μmol/L 對4-羥基異亮氨酸產量無明顯影響；FeSO4添加量為30 μmol/L時，4-羥基異亮氨酸產量為43.4 g/L， 提高5.6%；但其高于30 μmol/L時，4-羥基異亮氨酸產量不再提高。檢測了該條件下IDO活性變化，結果如圖5所示，于20 h添加FeSO4后，IDO活性緩慢提升，40 h后達到穩定狀態。綜上，FeSO4添加工藝優化后，4-羥基異亮氨酸產量提高13.6%。

表6 發酵過程添加FeSO4對4-羥基異亮 氨酸發酵參數的影響Table 6 Effects of FeSO4 addition during fermentation process on parameters of 4-hydroxyisoleucine fermentation

3 結論

結合菌株C.glutamicumHIL18特性優化了溶氧水平，20%的溶氧有利于4-羥基異亮氨酸的合成。根據C.glutamicumHIL18發酵過程中對溶氧需求的變化，提出兩階段溶氧控制工藝，0～20 h、20%溶氧，20～64 h、30%溶氧，在此條件下，4-羥基異亮氨酸的產量為38.7 g/L，提高11.2%。為避免Fe2+被氧化，在兩階段溶氧控制策略的基礎上采用兩階段FeSO4添加策略，初始濃度為65 mmol/L、20 h添加30 mmol/L， 4-羥基異亮氨酸的產量為43.4 g/L。采用優化后的工藝使得4-羥基異亮氨酸產量較優化前提高27.3%。本文優化了4-羥基異亮氨酸發酵過程中的溶氧水平，但其機制尚不明確。今后工作擬從基因轉錄及代謝流等角度開展溶氧水平影響C.glutamicumHIL18合成4-羥基異亮氨酸的機制研究，以期為進一步優化其發酵工藝提供依據。