天然發酵產物γ-聚谷氨酸修飾金納米星及其pH響應性

關樺楠，龔德狀，宋巖，韓博林，梁金鐘，王薇，宇佳

1(哈爾濱商業大學 食品工程學院，黑龍江 哈爾濱，150076) 2(東北林業大學 林學院，黑龍江 哈爾濱，150040)

以金納米粒子為代表的貴金屬納米材料因其具有良好的生物相容性、較大的比表面積和活躍的光電化學性質，已被廣泛應用于生物分析檢測領域[1-4]。金納米粒子具有典型的表面等離子體共振特性，且不同形態的金納米粒子(顆粒狀、棒狀、線狀和星狀)具有不同的共振特性[5-7]，這使其具有特定的尺寸效應，即當粒子間隙大于平均粒徑時，整個體系呈現出肉眼可見的酒紅色，而當粒子間隙小于平均粒徑時，體系顏色由酒紅色向藍紫色轉變[8-11]。根據這一特性，可以通過金納米粒子體系顏色的變化來判斷粒子間的分散和團聚。聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid，PGA)具有良好的生物相容性、生物可降解性和水溶性等特性，是醫藥、食品、水處理、農業等行業的研究熱點[12-16]。利用微生物天然發酵產物聚合制備γ-PGA，原料易得且可循環再生，符合可持續發展的觀點，具有很好的經濟價值和應用前景[17-19]。本實驗選取CTAB還原法制備出星狀金納米粒子，且表面帶有正電荷；選擇表面帶有負電荷的聚谷氨酸，依靠靜電吸附作用，修飾在金納米星的表面；利用聚谷氨酸在不同pH條件下，因其氨基酸結構發生變化所造成的金納米星發生自組裝-去自組裝的變化，進而來考察聚谷氨酸修飾金納米星(poly-γ-glutamic acid-stabilized gold nanoparticles, PGA-AuNPs)在不同的酸堿度條件下的響應情況。本實驗將為食品工業生產、醫藥研發和環境保護等領域開發新型pH敏感響應材料提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

用于發酵生產聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌，由哈爾濱商業大學食品工程學院發酵工程實驗室改良提供；氯金酸、K2CO3、AgNO3和抗壞血酸，均購自國藥集團化學試劑有限公司；十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)和硼氫化鈉，購自上海振興化工一廠；本實驗所用試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

2000 EX透射電子顯微鏡，日本JEOL公司；UV2250紫外-可見光分光光度計，北京桑翌科技發展有限公司；F2500型熒光分光光度計，日本日立公司；MAGNA-IR560E.S.P型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet公司；BT-9300H激光粒度分布儀，中國昆山廣測儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 星狀金納米粒子的制備與表征

在20 mL錐形瓶中依次加入10 mL的去離子水，5 mL 的CTAB溶液(0.2 mol/L)，2 mL的氯金酸溶液(10 g/L)。攪拌均勻后，快速加入0.6 mL的硼氫化鈉溶液(0.01 mol/L)持續溫和攪拌，當目測反應體系顏色加深時，停止攪拌，于室溫條件下，靜置2 h后備用，此為金種液。

將19 mL的CTAB水溶液(0.2 mol/L)與1 mL的氯金酸溶液(10 g/L)充分混合，再加入0.2 mL的AgNO3溶液(0.01 mol/L)，攪拌均勻后，加入0.2 mL抗壞血酸溶液(0.1 mol/L)，將0.2 mL金種液加入到反應體系中，靜置過夜，離心取沉淀，所得即為星狀金納米粒子。采用透射電子顯微鏡觀察金納米粒子的表觀形貌；采用紫外-可見光分光光度計測定金納米粒子的特征吸收峰。采用激光粒度分布儀測定金納米粒子的粒徑分布。

1.3.2 聚谷氨酸的發酵制備

在37 ℃條件下活化枯草芽孢桿菌種子液，振蕩培養 18 h(150 r/min)。將活化后種子液接種于發酵培養液中(接種量為3%)，隨后繼續在37 ℃條件下振蕩培養 72 h。將發酵液離心去沉淀(4 000 r/min，30 min)，向上清液中加入無水乙醇(1∶2，體積比)，劇烈振蕩后得到絮狀沉淀物，離心取沉淀(4 000 r/min，30 min)， 用無水乙醇水溶液清洗2遍，置于真空干燥箱中下烘干備用，此為PGA固體粉末。

1.3.3 聚谷氨酸修飾金納米粒子的制備與表征

向20 mL所制備的金納米星體系中加入質量濃度為10 mg/L的聚谷氨酸膠體溶液5 mL，室溫條件下溫和攪拌3 h(50 r/min)，然后離心去除上清液(4 000 r/min)，采用去離子水清洗沉淀2次，用以去除多余的聚谷氨酸膠體，真空干燥后所得固體即為聚谷氨酸修飾的金納米星(PGA-AuNPs)，采用去離子水稀釋備用，4 ℃條件下貯存。采用紫外-可見分光光度計測定PGA-AuNPs特征吸收峰。采用傅里葉變換紅外光譜儀對PGA-AuNPs表面基團結構進行分析。

1.3.4 不同pH條件下PGA-AuNPs的比色傳感

取2 mL PGA-AuNPs膠體(20 g/L)置于10 mL的離心管中，添加2 mL去離子水，再采用NaOH或HCl調節體系pH，總體系計為8 mL，采用去離子水補齊體系。充分混勻后，靜置10 min，觀察整個體系顏色的變化。

1.3.5 不同pH條件下PGA-AuNPs的熒光強度變化

取2 mL PGA-AuNPs膠體(20 g/L)置于10 mL的離心管中，添加2 mL去離子水，再采用NaOH或HCl調節體系pH，總體系計為8 mL，采用去離子水補齊體系。充分混勻后，靜置10 min，待顏色穩定后，于3 mL 具塞比色皿中，準確加入2.5 mL的該體系溶液，在熒光分光光度計上，設激發和發射光譜通帶為5.0 nm，以λex=λem方式進行同步掃描，并在波長430 nm處測定體系的熒光強度。

2 結果與分析

2.1 星狀金納米粒子的表征

本實驗擬采用靜電吸附法，將帶有負電荷的聚谷氨酸修飾于所制備的金納米粒子表面，因此需要制備出表面帶有正電荷的金納米粒子。利用晶種生長法，以CTAB作為還原劑和保護劑制備帶有正電荷的星狀金納米粒子。由圖1可知，采用晶種生長法所制備的金納米粒子在紫外-可見光光譜中，于波長527 nm處具有明顯的特征吸收峰，此為金納米粒子的表面等離子共振吸收峰，初步判定所制備的粒子為金納米星。

圖1 CTAB法制備的金納米星的紫外-可見光吸收光譜Fig.1 UV-VIS spectra of star likegold nanoparticles were prepared by CTAB method

采用透射電子掃描電鏡對所制備的金納米星的表觀形貌進行表征。由圖2可知，CTAB晶種生長法所制得的金納米粒子并非是圓球形，而是呈現五角星狀，且分布較為均勻，沒有出現明顯的團聚的現象，目測粒徑大小 20～30 nm。

A-放大6 000倍；B-放大8 000倍圖2 CTAB法制備的金納米粒子的透射電子顯微鏡圖片Fig.2 TEM images of gold nanoparticles were prepared by CTAB method

至于金納米星的形成，是因為在CTAB還原而成的晶種生長過程中，不同劑量的CTAB和AgNO3會改變晶種生長的方向，以放射狀的形式累積，進而生長為星狀結構。采用激光粒度分布儀測定金納米星的平均粒徑為(28.93±8.96) nm，采用電位儀測得金納米星表面電勢為21 mV，說明其表面帶有正電荷。

2.2 PGA-AuNPs的制備與表征

由于金納米粒子與聚谷氨酸之間的靜電引力，當提高聚谷氨酸的濃度并在加入的同時快速攪拌金納米星溶膠與聚谷氨酸的混合液時，金納米星表面的會被聚谷氨酸酸所取代，從而使金納米星表面的電荷發生偏轉，并穩定存在于溶液中[20-22]。聚谷氨酸修飾前后的金納米星紫外-可見光光譜如圖3所示。由圖可知，聚谷氨酸修飾后金納米星的吸收峰發生紅移。一般研究認為，隨著金納米粒子的粒徑增大，其紫外-可見吸收光譜峰展寬且向長波方向移動，該結果說明聚谷氨酸的修飾造成了金納米粒子粒徑的增大[21]，從一定意義上來講，聚谷氨酸已成功包覆在了金納米粒子的表面。

圖3 聚谷氨酸修飾前后紫外-可見光吸收光譜Fig.3 UV-VIS spectra of poly glutamic acid before and after modification

為進一步確定聚谷氨酸是否修飾在金納米星的表面，采用紅外光譜表征其表面基團結構。由圖4可知，在PGA-AuNPs的紅外光譜中，分別在1 657和 1 597 cm-1處具有酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ特征峰。同時在1 628 和1 423 cm-1出現兩個峰，分別歸屬于-NH3+變形振動峰和-COO-對稱伸縮振動吸收峰，在1 022.94 cm-1處有C-O伸展峰得到加強，說明通過靜電作用PGA已成功修飾于金納米星的表面[21，23-25]。

圖4 PGA-AuNPs的傅立葉紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of PGA-AuNPs

2.3 PGA-Au的pH響應性研究

一般研究認為，枯草芽孢桿菌的天然發酵產物γ-聚谷氨酸的等電點PI在4～5。而此類聚谷氨酸的結構對體系中的pH十分敏感。當體系中的pH高于等電點時，聚谷氨酸的二級結構會發生隨即卷曲[26-27]；而當體系中的pH低于等電點時，結構開始逐漸轉變為ɑ-螺旋[27]。在結構轉變的過程中，聚谷氨酸表面的電荷會發生反轉，導致具有不同電荷的聚谷氨酸產生靜電吸附，彼此聚集，正是根據此原理選擇聚谷氨酸修飾金納米粒子。不同的pH值能夠誘導聚谷氨酸的結構發生變化，進而引起金納米粒子的組裝和去組裝，整個過程可以通過金納米星的顏色變化顯示出來，從而可以實現其對pH敏感響應的目標。設置pH值為1～12，加入PGA-Au納米粒子，反應一段時間后，觀察顏色變化，見圖5。

圖5 PGA-AuNPs的pH響應比色研究Fig.5 Study on pH response colorimetric of PGA-Au

由圖5可知，pH值為4時，為PGA-AuNPs的初始顏色，加入體系中后顏色幾乎沒有發生變化；pH值為3時，體系為酒紅色，粒徑相比于pH為4的體系時稍有減小，說明當pH低于等電點時，聚谷氨酸與金粒子解體，使得粒徑減??；當pH值為1和2時，解離后的金納米星在聚谷氨酸的作用下迅速聚集，因此比色反應體系為灰色；當pH值為5～11時，顏色逐漸由淡紫色變為紫色，說明pH高于等電點后，開始改變聚谷氨酸的結構，使得金納米粒子開始緩慢聚集；當pH值為12時，體系變為藍灰色，粒子大量聚集成團，形成沉淀。

一般研究表明，金納米粒子聚集后會使得表面等離子體共振散射強度衰弱，進而引起熒光強度的減弱[21]。實驗中采用熒光光譜評估金納米星在不同pH條件下的熒光強度變化，結果見圖6。

圖6 PGA-Au的pH響應體系的熒光光譜圖Fig.6 Fluorescence spectra of PGA-Au pH response system

由圖可知，當pH值為4時，PGA-AuNPs具有最強的熒光強度，伴隨pH的變化，PGA-AuNPs的熒光強度逐漸發生衰退，其熒光強度的分布規律與比色體系中的基本一致。

3 結論

本研究采用CTAB法成功制備出表面帶正電荷的星狀金納米粒子，并利用天然發酵產物聚谷氨酸修飾金納米星，構架出對pH敏感的新型納米材料。研究結果表明所制備的金納米星粒徑分布均勻，針對不同的pH會產生規律的變色，同時也會造成體系熒光強度的變化。根據此結果，可以使得所制備的pH敏感金納米星，應用于諸多領域。本實驗將為開發新型pH敏感材料提供基本材料，為食品工業和醫藥工業的發展積累基礎數據。