YEATS域含蛋白質4在胰腺癌組織中的表達及預后意義

陳吉祥，章俊亞，黨勝春，錢小寶，崔磊

（1． 江蘇大學附屬醫院 普通外科，江蘇 鎮江 212001；2． 江蘇大學臨床醫學院，江蘇 鎮江 212013）

胰腺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因之一，其發病率逐年增加[1]。胰腺癌是一種生存率極低的高度侵襲性惡性腫瘤，預后極差，總體5年生存率低于5%[2]。由于胰腺癌患者缺乏特異性癥狀，使得早期診斷困難，通常診斷時已經處于發生局部浸潤和遠處轉移的疾病晚期，從而延誤了手術切除時機[3-6]?；煾纳屏嗽S多癌癥的預后，但其對胰腺癌的治療效果非常有限，正是由于胰腺癌對化療藥物具有高度的抗性[7]。目前胰腺癌的發病機制仍不清楚，因此迫切需要確定胰腺癌的治療靶點、預后標記物和新的治療策略，以對胰腺癌患者的生存提供有意義的影響。

YEATS域含蛋白質4（YEATS domaincontaining protein 4，YEATS4）是一種高度保守的核蛋白，屬于YEATS家族結構域蛋白，最初在人腦膠質瘤中被發現[8]。而YEATS結構域由5種YEATS家族結構域蛋白YAF、ENL、AF9、TAF14、SAS5首字母命名[9]。相關報道證實ENL的YEATS結構域通過識別結合組蛋白H3尾部的乙?；揎椩鰪姲籽∠嚓P基因的表達，導致急性白血病發生[10]。目前，YEATS4已被發現參與了致癌過程。YEATS4基因擴增于非小細胞肺癌，抑制p53通路促進肺癌細胞增殖并抑制細胞凋亡[11]。據報道[12]，YEATS4作為一種轉錄調控因子，與卵巢癌細胞的耐藥性密切相關。此外，敲低YEATS4蛋白表達可抑制結直腸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡[13]。然而，YEATS4在胰腺癌中的功能尚不清楚。本研究利用組織芯片技術及免疫組化方法檢測YEATS4在80例胰腺癌組織及相應癌旁組織的表達，分析YEATS4在胰腺癌中的表達與臨床病理特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料來源

YEATS4抗體購自于臺灣Abnova公司，收集了2011年3月—2017年8月于江蘇大學附屬醫院行手術切除以及經病理確診的80例胰腺導管細胞癌（pancreatic ductal carcinoma，PDAC）患者的臨床資料及組織樣本。本研究已經通過倫理委員會批準及患者本人知情同意。所有患者術前均未接受任何治療，樣本包括胰腺癌組織及相應癌旁組織。其中男42例，女38例；年齡36～83歲，中位年齡為68歲。

1.2 構建組織芯片

選取80例胰腺癌患者的組織標本，每例標本包含2個位點（胰腺癌組織及相應癌旁組織），共計160個位點，制作我們所需要的組織芯片微陣列。同時充分記錄了患者的臨床病理信息，包括患者的性別、年齡、腫瘤部位、病理分級、腫瘤分期、淋巴結轉移、神經轉移、脈管侵犯和隨訪數據（截至2018年5月）。

1.3 免疫組織化學法檢測YEATS4的表達

胰腺癌組織和正常胰腺組織經10%的福爾馬林固定脫水，常規石蠟包埋后，4 μm連續石蠟切片。采用ABC法進行免疫組織化學的檢測，蘇木精復染核。IgG代替YEATS4做一抗，檢測YEATS4的特異性。陽性定位于胰腺癌細胞胞核，細顆粒狀。

1.4 結果判定

兩位病理醫師在對臨床數據不知情的情況下，對染色結果進行評分。染色強度分為：0，無染色；1+，淡黃；2+，黃色；和3+，棕黃。陽性腫瘤細胞的比例分為3個水平：0分（＜10%），1分（20%～24%），2分（25%～50%），3分（＞50%）。染色指數（SI）計算為染色強度評分與陽性評分的乘積。 最佳截斷值被確定如下：SI得分＞ 3為陽性表達；SI得分≤3為陰性表達[14]。

1.5 統計學處理

采用統計學軟件SPSS進行統計分析，通過χ2檢驗分析YEATS4表達與臨床病理特征之間的關系。Kaplan-Meier法計算生存率，并且繪制生存曲線。運用Log-rank檢驗，取α=0.05為檢驗水準，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床病理特征

本組80例胰腺癌患者詳細臨床數據資料。男性52.5%（42例），女性47.5%（38例）；中位年齡68（36～83）歲；低分化者26.25%（21例），中分化者48.75%（39例），高分化者25%（20例）；TNM分期為I/II期者46.25%（37例），III/IV期者53.75%（43例）；有神經轉移者50例，無神經轉移者30例；有淋巴結轉移者40例，無淋巴結轉移者 40例；有脈管侵犯者33例，無脈管侵犯者47例。

2.2 YEATS4蛋白在胰腺癌組織及胰腺癌旁組織的表達

YEATS4蛋白在胰腺癌組織及胰腺癌旁組織的表達主要在細胞核。YEATS4在胰腺癌組織中的表達明顯高于與其對應癌旁組織中的表達（P＜0.05）（圖1）。胰腺癌組織中YEATS4陽性表達者45例（56.25%），在癌旁組織中陽性表達者為21例（26.25%），胰腺癌組織高表達率高于在胰腺癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 免疫組化法檢測YEATS4蛋白表達（×200）Figure 1 Immunohistochemical staining for YEATS4 protein expression (×200)

2.3 YEATS4的表達與臨床病理特征之間的關系

分析結果顯示，YEATS4蛋白表達與胰腺癌患者的性別、TMN分期、神經轉移、淋巴結轉移及脈管侵犯均有明顯關系（均P＜0.05）（表1）。

表1 YEATS4蛋白表達與患者臨床病理特征的關系[n（%）]Table 1 Relationship between YEATS4 protein expression and clinicopathologic features of patients [n (%)]

2.4 YEATS4的表達與預后的關系

經Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗顯示，YEATS4陽性表達組的中位生存時間為15.44個月，陰性表達組的中位生存時間為26.10個月，YEATS4的陽性表達組的預后較陰性表達組差，差異有統計學意義（χ2=7.593，P=0.0059）（圖2）。分別分析YEATS4在TMN分期、淋巴結轉移、神經轉移和脈管侵犯患者中的表達與預后的關系，結果顯示，YEATS4陽性表達的胰腺癌患者的不良預后與淋巴結轉移、神經轉移及腫瘤臨床分期相關（圖3）。單因素分析提示，YEATS4蛋白表達、TMN分期及淋巴結轉移與患者生存預后緊密相關（均P＜0.05），多元Cox回歸模型分析結果證實，YEATS4蛋白表達可以作為胰腺癌患者預后的獨立危險因素（HR=2.1，95% CI=1.1～4.2，P=0.026）（表2）。

圖2 YEATS4陽性與陰性胰腺癌患者生存曲線Figure 2 Survival curves of pancreatic cancer patients with positive and negative YEATS4 expression

圖3 不同臨床病理因素胰腺癌患者中YEATS4表達與生存率的關系Figure 3 Relationship between YEATS4 and prognosis in pancreatic cancer patients with different clinicopathologic features

表2 胰腺癌患者預后因素分析Table 2 Analysis of prognostic factors for pancreatic cancer patients

3 討 論

YEATS4位于人類染色體區域12q13-15，其蛋白含有227個氨基酸，分子量為26.7 kD。YEATS4在C-末端具有帶負電荷的α-螺旋結構，這是真核轉錄因子激活域的典型特征，也是蛋白質-蛋白質相互作用區域[8]。N端結構域是由YEATS蛋白家族中高度保守的tf2f結構域組成[15]。Ding等[16]報道YEATS4可以作為轉錄共激活劑用于AP-2β以增強其DNA結合活性。先前研究指出YEATS4與人類MLLT1和MLLT3蛋白具有高度的序列同源性，表明編碼的蛋白可能代表某種轉錄因子，可以通過 C末端激活域與髓細胞-淋巴細胞白血?。╩yeloid-lymphoid leukemia，MLL）編碼蛋白AF10相互作用，參與白血病的發生和發展[17]。YEATS4通過與一般轉錄因子TFIIF相互作用，在RNA轉錄過程中起著重要作用[18]。最近研究[19]表明，YEATS4是一個關鍵的RNA干擾（RNA interference，RNAi）組分，可使細胞核中RNAi過程正常進行。以上研究表明YEATS4在RNA轉錄過程中的重要性，參與了細胞增殖、分化和致癌等過程。

本次研究結合應用了免疫組化技術和臨床數據資料分析揭示YEATS4在胰腺癌組織中的異常表達及預后意義。研究結果顯示，YEATS4在胰腺癌組織中的表達顯著高于正常組織及癌旁組織，差異具有統計學意義（P＜0.05）。同時，YEATS4表達與性別、TMN分期、神經轉移、淋巴結轉移、脈管侵犯有關（P＜0.05），而與年齡、腫瘤部位、分化程度無關。這說明胰腺癌的發生是一種漸進逐步發展的過程，YEATS4可能參與了胰腺癌的發展和轉移過程。生存分析表明YEATS4蛋白陰性表達組與陽性表達組相比具有生存優勢，生存期相對延長。此外，發現在YEATS4高表達的胰腺癌患者中臨床分期較晚（III～IV）、有淋巴結轉移及神經轉移的預后相對較差。單因素及多因素回歸分析結果進一步證實了YEATS4蛋白表達可作為胰腺癌患者預后的獨立危險因素。

多數研究表明，多種類型腫瘤具有沿神經侵襲的生物學特性，是影響腫瘤患者術后生存質量的重要因素。胰腺癌細胞可直接浸潤神經束膜或束膜周圍的脈管，侵犯神經，形成新的轉移灶，是造成胰腺癌患者嚴重背痛和術后復發的原因。Ji等[20]發現YEATS4調節細胞核和細胞裂解液中β-鏈接蛋白（β-catenin）的表達和磷酸化，同時，YEATS4直接調控β-catenin的轉錄表達并調控β-catenin啟動子區的乙?；?。胞質β-catenin的磷酸化/降解過程調節著Wnt經典信號通路，Wnt/β-catenin通路是誘導上皮組織上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）產生的關鍵信號轉導通路[21]。Schmalhofer等[22]證實EMT發生后，腫瘤細胞的侵襲能力將明顯增強。由此推測YEATS4可能通過間接調控Wnt/β-catenin通路來誘導胰腺癌上皮EMT的發生，從而引起癌細胞的侵襲和轉移，有待后續基礎實驗的進一步驗證。

本次研究應用了組織芯片技術，進一步證實了YEATS4在胰腺癌組織中的高表達與預后價值，將對胰腺癌靶向藥物治療的研發及胰腺癌患者的術后評估提供重要的理論依據和臨床指導。