動靜脈特異性內膜增生信號通路的研究現狀

付品婷，鄔光敏，郭媛媛

（昆明醫科大學附屬心血管病醫院/云南省阜外心血管病醫院 血管外科，云南 昆明 650032）

動靜脈特異性內膜增生引起的血管狹窄，往往是自體靜脈移植、人工或組織工程血管植入、腔內支架置入術后血管再狹窄的主要原因，目前研究發現動靜脈分子指紋EphrinB2/EphB4參與內膜增生過程的調控，本綜述對EphrinB2/EphB4參與介導的相關信號通路作闡述，以期為臨床干預提供方向。

1 動靜脈分化和血管分子指紋

中胚層細胞分化形成的原始毛細血管網經過個體復雜的血管生成、分化，重構為動脈、靜脈和淋巴管網[1]，動脈與靜脈不僅僅存在結構與功能的區別，兩者更具有基因水平上的差異，在促紅細胞生成素肝細胞激酶受體（erythropoietinproducing hepatocyte kinase receptor，Eph）及其Ephrin配體家族中，EphB4、EphrinB2在胚胎發育期血管中的表達較的其他成員出現時間更早，EphB4在E9.0（小鼠）就表達于靜脈內皮，而EphrinB2比EphB4稍早（E8.5），EphrinB2/EphB4不對稱分布于動靜脈內皮細胞 ，提示EphrinB2/EphB4參與原始血管動靜脈分化[2-3]。在成年動物血管上，EphrinB2、EphB4分別分布于動脈、靜脈內皮細胞及平滑肌細胞[4]，并分別維持著成年動物動靜脈的結構及功能穩定，是動靜脈的分子指紋。

1.1 EphrinB2/EphB4的表達調控

發育生物學研究結果提示：決定EphrinB2/EphB4恰當表達，進而決定動靜脈分化的上游因素可能是Notch信號途徑，血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）部分或主要參與了Notch途徑的激活[5]。在動脈成血管細胞前體中，VEGF-A/VEGF-R2與neuropilin-1（NRP1）形成復合物激活Notch信號，但VEGF-A/VEGF-R2/NRP1復合物的形成機制尚不明確，SOXF轉錄因子又與RBPJ蛋白相互作用，活化Notch，VEGF通過ETS家族轉錄因子上調Notch的關鍵配體Delta-like 4（Dll4），通過Delta-Notch途徑誘導動脈內皮細胞標志物EphrinB2的產生，促進動脈分化[6-7]（圖1A）。Sturtzel等[8]在斑馬魚模型中研究發現，轉錄因子FOXF1上調VEGFR-2和EphrinB2，這進一步說明Notch2、VEGFR-2和EphrinB2是FOXF1功能的下游介質。 在靜脈內皮細胞中，雞卵清蛋白上游啟動子轉錄因子II（chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor，COUP-TFII）通過抑制VEGF-A/VEGF-R2/NRP1復合物中的NRP1、Jagged-1和Notch信號分子的表達而誘導生成EphB4，但抑制EphrinB2的表達，Chen等[9]研究發現，抑制靜脈內皮COUP-TFII表達后，靜脈內皮上表達動脈標志物EphrinB2，靜脈逐漸出現動脈表型。VEGF下調EphB4和上調DII4都是通過MEK/ERK信號調控的，并不通過PI3K/Akt信號調控，PI3K-Akt通路通過抑制ERK/MAPK通路，積極促進靜脈分化[10]（圖1B）。在內皮細胞（endothelial cells，ECs）特異性缺失SMAD4的小鼠和魚類中，Neal等[11]證明SMAD4在獲得靜脈而非動脈特性時是必需的，另外在ECs中識別出一種包含必需SMAD結合基序和SMAD1/5結合的靜脈內皮特異性增強因子，結果表明，靜脈基因通過BMP/ALK3/SMAD1/5信號級聯直接轉錄激活，再次支持了內皮祖細胞在發育早期就獲得獨立信號通路決定下游的動靜脈分化。

1.2 VEGF-R2介導的信號通路

圖1 EphrinB2/EphB4的表達調控與動靜脈分化Figure 1 The expression of EphrinB2/EphB4 and arteriovenous differentiation

目前已知與血管內皮細胞功能有關的VEGF-R2下游傳導通路主要為3條：⑴ PLCγ-ERK1/2-RAF1-MEK-ERK1/2。該途徑在血管發育和成年動脈生成具有核心作用[12]，VEGFR2 Y1173磷酸化后結合并激活PLCγ，促進三磷酸肌醇（inositol 1，4，5-trisphosphate，IP3）和二酰甘油（diacylglycerol，DAG）的生成，IP3從內質網釋放鈣,支持依賴Ca2+的DAG誘導激活蛋白激酶Cβ2（PKCβ2），然后調節RAF1-MEK-ERK1/2級聯反應，這一途徑繞過了RTK誘導RAS激活的RAF1-MEK-ERK1/2級聯反應[13]。⑵ PI3K-AktmTOR通路，是內皮細胞存活、血管運動調節和屏障功能調節的關鍵通路[14]。⑶ SRC和小GTPases參與內皮細胞的形態、遷移和極化，以及內皮細胞間的連接和血管屏障功能的調節[15]。除此之外，VEGF-R2還激活了p38 MAPK、STATs和G蛋白偶聯受體（GPCR）依賴性信號分子。Sturtzel等[8]在斑馬魚模型中研究發現，轉錄因子FOXF1上調VEGFR-2和EphrinB2，而下調靜脈標志物EphB4的表達，這進一步說明Notch2、VEGFR-2和EphrinB2是FOXF1功能的下游介質。

2 動靜脈內膜特異性增生與EphrinB2/EphB4的相互作用

ECs損傷是血管內膜增生的病理基礎，ECs損傷后通過產生多種血管活性物質作用于血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs），促進VSMCs的表型轉換而加劇內膜增生，EphB4/EphrinB2的相互作用與這一過程密切相關。EphB4的特異性配體EphrinB2與其他可溶性配體不同，兩者均為跨膜蛋白，由糖基化細胞外域，跨膜區和胞內域組成，所以EphB4與EphrinB2之間相互作用調節血管生成，是通過細胞-細胞相互接觸而完成的，兩者可互為配體激活對方，目前大量研究認為以EphrinB2為配體激活EphB4為正向信號；反之以EphB4為配體激活EphrinB2為反向信號。

2.1 靜脈分子指紋EphB4激活后的正向信號通路

以EphrinB2為配體刺激EphB4磷酸化而激活系列下游信號通路，可誘導EC的遷移和增殖，其中下游信號分子PI3K/Akt共同作用于遷移和增殖過程，但在Akt后產生差異[16]。

PI3K/Akt-eNOs/NO通路為EphB4介導的ECs遷移的經典途徑，NO的下游信號通路可能是通過局灶性黏附激酶（focal adhesion kinase，FAK）傳導[17-18]。Steinle等[16]研究表明，PI3K/Akt-NFκB-MMP級聯也可能參與EphB4介導的ECs遷移，在EphrinB2/Fc誘導MM1細胞遷移中，EphB4陽性內皮細胞的PI3K/Akt信號通路被激活，隨之基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinases 2，MMP-2）和MMP-9被激活并發揮作用，其機制為MMP-9在其啟動子中有一個NF-κB結合位點，激活的Akt增加了NF-κB的轉錄激活，進而活化MMP-2和MMP-9[19-20]。

EphB4介導的內皮細胞的增殖主要通過PI3K/Akt-eNOs/NO-cGMP/PKG-Raf/MEK/MAPK通路進行調控[16,21-22]。研究顯示，Akt能特異性地使內皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthases，eNOS）磷酸化，增加亞硝酸鹽的產生，從而激活cGMP-PKG信號通路[23-24]。在Steinle等[16]研究中，使用PI3K、Akt、PKG、MEK的阻斷劑后，由EphrinB2-Fc誘導正向信號引起的內皮細胞增殖受到抑制。

研究[25]用EphrinB2-Fc處理人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），MEK/ERK通路受到抑制，p120RasGAP參與該通路的介導；但在乳腺癌細胞系MCF7細胞中，MCF7細胞在蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶2A（protein serine/threonine phosphatase 2A，PP2A）參與下Ras/ERK通路被激活。Adams等[26]同樣發現PP2A的亞單位AbαC與ABδC通過作用于Raf1下游及MEK1/2上游而正向調控Raf1-MEK1/2-ERK1/2通路，出現這樣的差異可能是不同細胞之間對同一分子的不同反應。另外，當在EphrinB2-Fc刺激下，靜脈分子指紋EphB4的持續表達也同樣可能通過ERK1/2途徑影響內皮細胞的遷移功能而影響移植靜脈重塑[27-28]。Cao等[29]通過共同培養人骨髓間充質干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，HBMSCs）和HUVECs發現EphrinB2和Ephs介導的雙向信號通路通過激活PI3K/AKT/mTOR通路，促進HUVECs血管生成，維持HBMSCs自分泌，促進骨缺損修復。而當EphrinB2或EphB4的敲低后會顯著抑制內皮發芽，導致毛細血管芽減少，血管生成減少[30]。

2.2 動脈分子指紋EphrinB2激活后的反向信號通路

激活EphrinB2反向信號可促進血管內皮細胞的黏附、遷移、趨化、毛細血管網形成和血管新生，與EphB4激活的正向信號不同的是，由于缺乏內在催化活性，EphrinB2介導的反向信號依賴于募集信號分子[31]。EphrinB2胞內區有5個保守的酪氨酸殘基和C端的PDZ結合域，其特有的結構提示EphrinB2可能通過酪氨酸磷酸化依賴和 PDZ 結合結構域介導2種方式向胞內傳遞信號[32-33]。

以EphB4為配體結合EphrinB2，快速募集Src家族激酶SFKs到EphrinB2附近，使EphrinB2酪氨酸殘基磷酸化，然后與接頭蛋白Grb4的SH2/SH3結構域以及轉錄激活因子STAT3相結合激活下游信號通路[34-35]，EphrinB-Grb4復合物可激活FAK催化活性，并招募G蛋白偶聯受體激酶相互作用蛋白（GIT）1；Grb4還可通過SH3結構域結合原癌基因c-CbI相關蛋白（CAP）、Abi相互作用蛋白（Abi-1）、Axin蛋白、動力蛋白（dynamin）、核內不均一核糖核蛋白體K（hnRNPK）、及p21活性蛋白激酶（Pak1）等下游信號分子，介導ECs的遷移[36-37]。STAT3與EphrinB結合后，JAK-2磷酸化并遷移至細胞核，在細胞核中調節多種靶基因，從而調控ECs的構成[38]。另外，Salvucci等[39]研究發現EphrinB2/STAT1/JNK3信號通路對玻璃體血管的重構至關重要，JNK3活化能促進內皮細胞凋亡，而EphrinB2通過招募SHP2維持內皮細胞活力，SHP2使STAT1去磷酸化，進而抑制JNK3活性，減少促凋亡信號的產生。

PDZ結構域介導EphrinB2反向信號可能與含PDZ結合基序的蛋白質被募集到PDZ結構域有關。Ephrin/Eph反向信號通路與VEGFR通路交叉，EphrinB2可通過PDZ相互作用上調VEGFR2，而不依賴于誘導酪氨酸磷酸化，正向調控病理性血管生成[33,40]，Warren等[41]發現，PDZ結合域的缺失在生理和病理條件下使小鼠體內血管生成減少。此外，參與腫瘤細胞轉移和血管生成的PI3K/AKT/mTOR和MAPK信號通路是VEGFR2介導信號通路的下游靶點，文獻[42]報道塔斯品堿衍生物12k通過抑制EphrinB2的PDZ結合基序蛋白PICK1，降低EphrinB2磷酸化水平，從而影響VEGFR2信號通路。另外，在含PDZ的蛋白中，G蛋白信號轉導（PDZ-RGS3）和蓬亂蛋白2（disheveled-2，Dvl2）的調控可能與PDZ介導的EphrinB2反向信號轉導有關，PDZ-RGS3可能通過調節G蛋白信號通路部分介導EphrinB2反向信號通路，但下游效應蛋白目前尚不清楚[43]。

動靜脈分子指紋EphrinB2/EphB4信號通路與生物學功能詳見表1所示。

表1 動靜脈分子指紋EphrinB2/EphB4信號通路與生物學功能Table 1 The signaling pathways and biological functions of molecular fingerprints EphrinB2/EphB4

3 總結與展望

綜上所述，在靜脈特異性內膜增生中VEGF-A/VEGF-R2/NRP1/COUP-TFII途徑主要參與靜脈分子指紋EphB4的表達調控，BMP/ALK3/SMAD1/5信號級聯也可直接轉錄激活EphB4。以EphB4受體激活產生的正向信號，通過PI3K/AkteNOs/NO-FAK以及PI3K/Akt-NF-κB-MMP途徑促進ECs遷移；PI3K/Akt-eNOs/NO-cGMP/PKGRaf/MEK/MAPK通路調控ECs增殖，此外PI3KAkt-mTOR通路，也是ECs存活、血管運動調節和屏障功能調節的關鍵通路。在動脈特異性內膜增生中，FOX1/VEGF-A/VEGF-R2/NRP1/PI3K-Akt/Dll4-Notch/RBPJ/EphrinB2途徑主要參與EphrinB2的表達調控，以EphB4為配體結合EphrinB2后可能通過酪氨酸磷酸化依賴和 PDZ 結合結構域介導2種方式向胞內傳遞反向信號，調控血管生成與重構。盡管與VEGF、EphB4、EphrinB2相關的信號通路研究較為成熟，但VEGF家族中其它因子之間的相互作用以及Eph家族中其它成員與血管生成、重構的關系尚未清楚，Ephrin/Eph信號是如何與細胞骨架和基因轉錄相互作用也不明確，兩者信號通路是否會與其他非經典途徑相交叉也不得而知。對于在臨床上的應用，更多也是的集中于腫瘤的抗血管生成治療[44]以及骨缺損修復治療，對于血管術后再狹窄的治療并不如預期廣泛，若能從動靜脈特異性內膜增生信號通路上的異同出發，將動脈與靜脈內膜增生區別開，針對性地阻斷其中的信號通路，從而更好地解決動脈或靜脈損傷后的再狹窄問題。