梅魚內臟酶解液美拉德反應工藝優化及揮發性物質分析

徐靜馨,陳 靜,2,*,唐 琪,鄧尚貴,2

(1.浙江海洋大學食品與醫藥學院,浙江舟山 316022; 2.浙江省海產品健康危害因素關鍵技術研究重點實驗室,浙江舟山 316000)

美拉德反應又稱為“非酶棕色化反應”,是一種廣泛存在于食品工業的非酶褐變,是羰基化合物和氨基化合物間的反應,所以又稱羰氨反應。美拉德反應是食品加工過程中產生誘人色澤和各種芳香風味的主要原因,也是目前各種香精制備的主要工藝。目前,國內外有很多關于美拉德反應的報道[1-2]。近幾年的研究發現,美拉德反應產物可以改善反應底物原有的生物活性,賦予其抗氧化、降血壓、抗菌活性、抗癌、抗誘變等多種生物活性[3-5]。

梅魚作為我國主要的海洋加工魚類,產量和需求量相當大。在加工生產中,作為下腳料的魚頭、魚骨和內臟往往被加工成魚粉或直接作為廢物被處理,造成大量的浪費,高值化利用程度較低。因此綜合利用梅魚下腳料,提高梅魚下腳料高值化利用具有重要意義。目前,將水產品下腳料酶解液與適當的還原糖通過美拉德反應制備具有風味獨特的調味品受到廣泛關注。如劉安軍等[6]以帶魚下腳料酶解液為原料,添加一定比例的還原糖和氨基酸,通過美拉德反應制備香精;董志儉等[7]以魷魚內臟酶解液為基料,利用美拉德反應制備魷魚味香精;從艷君等[8]將草魚內臟蛋白酶解液與葡萄糖進行美拉德反應后制備出了風味良好的調味基料。目前,利用梅魚內臟酶解液為基料,與還原糖進行美拉德反應制備風味物鮮有報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅魚內臟 浙江興業集團有限公司,冰藏條件下當日運至實驗室進行實驗;木瓜蛋白酶(酶活力1000 U/mg) 上海金穗生物科技有限公司;其它試劑 均為市售分析純;實驗用水 為蒸餾水。

HWS-12電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學儀器有限公司;CR21G型冷凍離心機 日本日立公司;DZF-6021型真空干燥箱 上海一恒科技有限公司;S-3C型pH計 上海虹益儀器儀表有限公司;高速低溫離心機A1301019 上海艾測電子科技公司;TM-767型攪拌機 中山市海盤電器有限公司;AR124CN 電子天平 奧豪斯儀器有限公司;UV1100紫外分光光度計 上海美普達公司;75 μm CAR/PDMS/DVB萃取纖維頭 美國SUPELCO公司;HP-INNOWAXS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國Agilent公司SHIMADZU;Agilent 7890A/5975C氣-質聯用儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 梅魚內臟的酶解 參考劉建偉等[28]的方法,改進后稱取50 g梅魚內臟放入燒杯中,按料液比1∶10 (m/v)加入蒸餾水,經高速勻漿后用氫氧化鈉溶液調節pH至6.5,加入1 g木瓜蛋白酶后攪拌均勻,在55 ℃條件下恒溫酶解5 h,酶解結束后,將酶解液在沸水浴中滅酶20 min,8000 r/min離心20 min,除去懸浮物,過濾,所得濾液即為梅魚內臟酶解液。

1.2.2 梅魚內臟酶解液美拉德反應的單因素實驗

1.2.2.1 糖種類和比例對梅魚內臟酶解液美拉德產物的影響 量取20 mL的上述酶解液于燒杯中,將酶解液用氫氧化鈉溶液pH調至7,分別添加0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 g的葡萄糖或木糖,或加入總量1 g的不同比例(葡萄糖和木糖的配比為4∶1、3∶2、1∶1、2∶3和1∶4)的混合糖,封口置于真空干燥箱中,在100 ℃下反應100 min,冷卻后,用紫外分光光度計在420 nm[9]處測量吸光度,用以表示美拉德反應產物褐變程度,并進行感官評分。

1.2.2.2 pH對梅魚內臟酶解液美拉德產物的影響 量取20 mL的上述酶解液于燒杯中,加入5%葡萄糖攪拌均勻,調節pH分別至5、6、7、8、9和10,封口置于真空干燥箱中,將酶解液在100 ℃下反應100 min,冷卻后,用紫外分光光度計在420 nm處測量吸光度,用以表示美拉德反應產物褐變程度,并進行感官評分。

1.2.2.3 反應時間對梅魚內臟酶解液美拉德產物的影響 量取20 mL的上述酶解液于燒杯中,將酶解液pH調至7,加入5%葡萄糖攪拌均勻,封口置于真空干燥箱中,在100 ℃下分別反應20、40、60、80、100和120 min,冷卻后,用紫外分光光度計在420 nm處測量吸光度,用以表示美拉德反應產物褐變程度,并進行感官評分。

1.2.2.4 溫度對梅魚內臟酶解液美拉德產物的影響 量取20 mL的上述酶解液于燒杯中,將酶解液pH調至7,加入5%葡萄糖攪拌均勻,封口置于真空干燥箱中,分別在70、80、90、100、100和120 ℃下反應60 min,冷卻后,用紫外分光光度計在420 nm處測量吸光度,用以表示美拉德反應產物褐變程度,并進行感官評分。

1.2.3 正交試驗 在上述單因素實驗的基礎上,以感官評分作為考察指標,對pH、溫度、時間和糖混合比例采用四因素三水平正交表對反應條件進一步優化,其因素水平表如表1。

表1 正交因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 美拉德反應產物感官評定 感官評定采用評分檢驗法[10]。挑選食品專業的10名感官評定人員,評價指標用魚腥味、香味、刺激氣味等來表示(表2),對美拉德反應產物的樣品逐個進行評分,最終得出感官綜合評分。

表2 感官評分標準Table 2 The standard of sensory evaluation

1.2.5 美拉德反應產物的揮發性物質測定

1.2.5.1 頂空固相微萃取法(HS-SPME)提取揮發性成分 稱取5 g最優條件下制得的樣品置于20 mL頂空瓶中,密封,于50 ℃磁力攪拌器中加熱平衡20 min,用活化后的75 μm CAR/PDMS/DVB萃取纖維頭頂空吸附30 min后,將萃取頭插入GC進樣口解析,進入GC-MS 進行分離與分析[11]。

1.2.5.2 氣相色譜-質譜(GC-MS)條件 色譜條件:色譜柱:HP-INNOWAXS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣:高純He;載氣流速1.0 mL/min;進樣口溫度250 ℃;分流比5∶1進樣;升溫程序:起始溫度為40 ℃,保持5 min,以8 ℃/min升至250 ℃,保持5 min。質譜條件:電離方式EI;電子能量70 eV;電壓1800 V;連接口溫度250 ℃;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;質量掃描范圍30～500 m/z;質量掃描速率10000 amu/s。

1.2.6 梅魚內臟酶解液及其美拉德反應產物抗氧化活性的測定

1.2.6.1 羥自由基(·OH)清除率的測定 取一支10 mL試管,分別加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液、2 mL磷酸緩沖液(pH7.4)和1 mL去離子水,混勻之后,再加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液,加入1 mL雙氧水(0.12%,新鮮配制),混勻,在37 ℃水浴鍋中60 min,用去離子水調零,在536 nm處測定吸光度值,記作Ap;將1 mL雙氧水換做1 mL去離子水,記作Ab;將1 mL去離子水換做1 mL酶解液,記作As[12]。

式中:Ao為空白的吸光度;Ai為樣液的吸光度;Aj為酶解液的吸光度。

1.2.6.3 DPPH自由基(DPPH·)清除率的測定 1 mL DPPH無水乙醇溶液(10 mmol/L)+1 mL樣液作為實驗組;1 mL DPPH無水乙醇溶液+1 mL去離子水作為對照組;1 mL無水乙醇+1 mL樣液作為空白組,混勻,30 ℃避光靜置30 min,在535 nm處測定吸光度[14]。

式中:A1為樣液的吸光度;A2為空白的吸光度;A3為DPPH溶液的吸光度。

1.3 數據處理

每個試驗重復3次,采用Origin 8.5軟件作圖。采用SPSS V17.0軟件進行ANOVA差異顯著性分析,p<0.05 為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 葡萄糖、木糖添加量和葡萄糖與木糖配比對梅魚內臟酶解液美拉德產物的影響 糖種類及配比對梅魚內臟酶解液美拉德產物的影響結果如圖1所示。由圖1中a、b可知,420 nm處的吸光度不斷增加,說明兩種還原糖參與了美拉德反應,并且隨著還原糖含量的添加,美拉德反應逐漸進行,褐變程度隨之逐漸加深。然而當葡萄糖、木糖添加量達到1.2 g時,感官評分達到最大,分別為7.4、8.4,超過1.2 g時,感官評分開始下降。與葡萄糖參與的反應相比,木糖添加量在0.6～1.6 g時,木糖美拉德反應產物的感官評分要高于葡萄糖,說明木糖參與美拉德反應的效果略優于葡萄糖,相較于六碳糖葡萄糖,作為五碳糖的木糖,對美拉德反應的進行更有利。如圖1中c可知,隨著葡萄糖/木糖的比例逐漸減小，木糖占總糖比例的增加,美拉德反應不斷進行,褐變程度不斷加深。當葡萄糖與木糖比例為1∶1時,感官評分達到最大8.8,之后隨著葡萄糖/木糖比例減小，褐變程度的不斷加深,感官評分急劇下降,可能是因為隨著木糖含量的添加,美拉德反應產物會散發出不協調的酸味,干擾感官評分。

圖1 還原糖及其配比對梅魚內臟酶解液美拉德產物吸光值(420 nm)及感官評分的影響Fig.1 Effects of reducing sugars and their proportions on the absorption value(420 nm)and sensory score of plum visceral enzyme solution Maillard products

隨著葡萄糖/木糖比例的減小，褐變程度加深,具有香味的小分子物質不斷產生,而小分子物質又隨著反應的不斷深化,聚合成大分子物質,香味動態平衡的狀態被減弱甚至打破,這也可能是由于在反應過程中產生了刺激性氣味的物質或者焦苦味,掩蓋了原有的香味,降低了感官效果,且基于成本考慮,葡萄糖低于木糖。最終確定以葡萄糖∶木糖為1∶1為混合糖。

2.1.2 pH對梅魚內臟酶解液美拉德產物的影響 pH對梅魚內臟酶解液美拉德產物的影響結果如圖2所示。由圖2可知,當pH為5時,吸光值較小,說明美拉德反應的程度較低,之后隨著pH的增加,美拉德反應程度也隨之增加,在pH為9時,酶解液美拉德反應的程度最強,之后隨著pH的增加,美拉德反應產物褐變程度開始減輕。且在pH為9時,感官效果最佳(評分為6.8分)。一般來說,美拉德反應隨pH的升高而加劇,pH越大,反應越強,速度越快。在酸性條件下,美拉德反應主要產生糠醛(戊糖)或者羥甲基糠醛(HMF)(己糖),美拉德反應受到抑制,堿性條件下,葡糖氨重排產生還原酮,如丙酮醇、丙酮醛等物質會進一步參與美拉德反應[15]。因此選定反應體系的pH為9。

圖2 pH對梅魚內臟酶解液美拉德產物吸光值(420 nm)及感官評分的影響Fig.2 Effects of pH on the absorption value(420 nm)and sensory score of plum fish visceral enzyme solution Maillard products

2.1.3 反應時間對梅魚內臟酶解液美拉德產物的影響 美拉德反應過程中,氨基酸和還原糖逐漸反應,形成大量褐色含氮色素,即類黑精色素,環化產生一系列吡啶、吡咯、吡嗪等含氮雜環化合物[16]。反應時間對梅魚內臟酶解液美拉德產物的影響結果如圖3所示。如圖3所示,在20～120 min反應時間內,美拉德反應隨著時間的延長而加深,感官效果也隨之增強,然而其反應速率不斷減小,有可能是因為葡萄糖隨著反應進行而不斷消耗。美拉德反應越徹底,褐變程度隨之加深,感官評分也越高。在實驗進行到100 min時,感官評分達到最高為7.6分,120 min時，感官評分略有下降。因此最終確定反應時間為100 min。

圖3 反應時間對梅魚內臟酶解液美拉德產物吸光值(420 nm)及感官評分的影響Fig.3 Effects of reaction time on the absorption value(420 nm)and sensory score of plum fish visceral enzyme solution Maillard products

2.1.4 溫度對梅魚內臟酶解液美拉德產物的影響 溫度對梅魚內臟酶解液美拉德產物的影響如圖4所示。圖4顯示,當溫度70 ℃時,美拉德反應程度較低,之后隨著反應溫度的上升,吸光度增大,美拉德反應程度也隨之上升,在100 ℃后,溫度變化對吸光值和感官評分影響較小,當溫度達到120 ℃時,美拉德反應的程度最強，感官評分也隨著溫度的上升而不斷增加,在120 ℃達到最佳感官評分。溫度是影響美拉德反應程度的關鍵因素之一,升高溫度將增加糖和氨基酸的相互作用,從而增加反應速率,同時,溫度較高時會形成大量的揮發性物質。一般情況下,反應模式的溫度不能超過180 ℃,溫度過高,會產生較強烈的氣味。綜上,最終選取100、110、120 ℃作為正交水平。

圖4 反應溫度對梅魚內臟酶解液美拉德產物吸光值(420 nm)及感官評分的影響Fig.4 Effects of reaction temperatures on the absorption value(420 nm)and sensory score of plum fish visceral enzyme solution Maillard products

2.2 正交試驗結果

2.2.1 美拉德反應條件的正交試驗結果 在單因素實驗的基礎上,采用正交試驗對美拉德反應進行優化,結果及分析見表3。表3所示,影響美拉德反應程度因素的主次順序依次是C>A>B>D,即溫度>pH>時間>葡萄糖/木糖。美拉德反應最佳條件為A2B2C3D1,恰好是正交試驗中的一組,即當溫度為120 ℃、pH為9、反應時間為100 min、葡萄糖/木糖為1∶1時,感官評分最佳結果為7.48分。

表3 四因素三水平正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal experiment of four factors and three levels

2.2.2 驗證實驗 按上述最佳工藝條件,即反應溫度120 ℃、反應時間100 min、pH9.0、葡萄糖與木糖之比1∶1時進行3次平行實驗,梅魚內臟酶解液美拉德反應產物的感官評分的平均分為7.51±0.13。3次實驗的穩定性較好、誤差較小,說明正交實驗結果正確可行。

2.3 美拉德反應產物揮發性成分分析

從表4～表5可知,從梅魚內臟酶解液美拉德反應產物中總共檢測出89種揮發性風味化合物,其中醛類16種、含量46.79%;烴類12種、含量1.89%;酸類5種、含量2.11%;醇類8種、含量7.26%;呋喃類5種、含量3.04%;噻唑類5種、含量1.62%;吡嗪類4 種、含量1.31%;酯類11 種、含量24.84%;酮類9種、含量5.93%;其他化合物14種、含量5.21%。

表4 美拉德反應產物的揮發性風味物質Table 4 Volatile flavor compounds of Maillard reaction products

續表

表5 美拉德反應產物的揮發性風味物質種類及含量Table 5 Types and contents of volatile flavor substances in Maillard reaction products

占較高含量(46.79%)的醛類物質包含糠醛、3-糠醛、壬醛等,具有產生清香、果香和堅果香的特質[18],其中壬醛具有脂香味;糠醛具有獨特的烤肉香味[19];3-甲硫基丙醛對海鮮味[20]和肉香味[21]具有貢獻作用;己醛具有青草味[22]。

美拉德反應產物中檢測出醇類、酯類、酮類和酸類等,這些物質本身都帶有獨特的香味,具有去腥增香的作用,對梅魚內臟酶解液美拉德反應產物的風味形成具有重要的貢獻。含量為24.84%的酯類包含1,2-苯酸二乙酯、鄰苯二甲酸二乙酯等,具有顯著香味特征對肉香味增加有貢獻。酮類物質(含量5.93%)包含2-丙酮、β-紫羅蘭酮等,對魚肉氣味的貢獻相對較小,對腥味物質起增強作用[29]。呋喃類化合物及其衍生物會產生魚香味、煮魚香味等獨特的芳香[23]。噻唑類對肉的總體風味具有最基本的貢獻,它是美拉德反應的前期階段生成的,高溫是形成噻吩類物質的先決條件[24]。

噻唑類一般氣味強烈,對肉香味以及海鮮味具有重要貢獻意義[20]。吡嗪類化合物主要提供堅果味、燒烤味和甜味的產品[25],是風味化合物中重要的組成部分,也是美拉德反應的主要產物之一[26]。

2.4 美拉德反應產物的抗氧化活性

圖5 梅魚內臟酶解液及其美拉德反應產物的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of enzymatic hydrolysis solution of fish offal and its Maillard reaction product注:圖中小寫字母不同,表示顯著差異(p<0.05)。

3 結論