大米蛋白與米渣蛋白對鎘結合能力的對比研究

尹仁文,陳正行,李 娟,王 韌

(江南大學食品學院,江南大學食品科學與技術國家重點實驗室， 江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室,江蘇無錫 214122)

鎘是一種重金屬,不易降解,食用鎘會造成人體各種疾病,如神經痛、胃痛、骨質疏松癥等疾病[1-2]。而大米因水稻植株根部吸收鎘離子，經鎘結合轉運蛋白運輸至籽粒并被蛋白結合而可能會含有鎘元素,食用鎘大米會造成鎘在人體內積累,因此鎘大米的問題越來越引起社會的關注,我國南方部分地區,如湖南、廣西、江西等地的大米鎘超標現象較為嚴重[3]。研究指出,鎘主要結合在大米的蛋白部分,楊居榮等[4]研究了水稻籽粒中鎘的結合形態,指出大米中8%的蛋白富集了60%以上的鎘。趙新民[5]將鎘與蛋白質形成的絡合物定義為鎘結合蛋白。Stone等[6]提出鎘結合蛋白中的硫元素含量較高,何篤修等[7]純化出玉米根的鎘結合蛋白中含硫的半胱氨酸,其含量達29.6%。此外,鎘與羧基的結合存在特異性,翟齊嘯[8]研究表明,掩蔽乳酸菌菌體表面羧基,則乳酸菌對鎘的吸附能力下降18%。許多研究提出,鎘與大米蛋白的結合能力受大米蛋白種類的影響,這應該是大米蛋白中的羧基(-COOH)與巰基(-HS)共同作用結果所致。Liu等[9]研究了大豆分離蛋白與重金屬鎘的結合作用,在最優化條件下對鎘的最大結合量達到83.36 mg/g,并指出大豆蛋白與重金屬的結合的位點為巰基和羧基等親水性基團。

“鎘大米”的核心挑戰就是土壤污染,土壤中的鎘通過鈣離子通道,以離子交換的形式結合在植物根表面,進入根系后,由于植物螯合肽(PCs)的作用,鎘大部分累積在根系,少部分先通過轉運體進入共質體,再進入中柱進行木質部裝載,然后通過蒸騰作用被運輸至地上部器官[10]。土壤鎘污染造成鎘在農作物中積累,因此研究者提出土壤鎘鈍化修復是解決鎘大米的根本途徑[11]。這種途徑是:施用鈍化劑在鎘污染的農田中,與鎘結合,鈍化鎘活性,減少農作物對鎘的吸收。上述研究發現,鎘與大米蛋白的結合能力較強,因此,尋找一種與鎘結合能力強且廉價易得的大米蛋白作鎘鈍化劑是很有必要的。

米渣是大米在加工過程中產生的副產品,我國每年生產淀粉糖等產生副產品米渣3000多萬噸[12],米渣中含有40%～65%的蛋白[13]。米渣蛋白來源于大米蛋白且廉價,目前大部分米渣用作動物飼料,但工業附加值低;少部分米渣用作生產大米蛋白粉或蛋白肽,但是各種生產工藝均存在缺陷,如成本高、操作復雜、產品質量差等;還有少量的米渣被直接丟棄,造成了嚴重浪費[14-15]。因此,研究米渣蛋白與鎘的結合能力,探討其應用價值,能夠在一定程度上減少米渣資源的浪費,充分利用米渣資源。本研究對比研究大米蛋白與米渣蛋白與鎘的結合能力,為米渣蛋白在鎘鈍化方面的研究提供依據,拓寬米渣的應用范圍,為其在農業上應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米蛋白質 含量7.9%,產自江西的先農早秈米;米渣蛋白質 含量57.58%,江西恒天實業有限公司;高溫淀粉酶 20000 U/mL,Novozyme公司;復合纖維素酶 10000 U/g,Novozyme公司;氯化鎘、鹽酸、氫氧化鈉、EDTA(乙二胺四乙酸)、DTNB(5,5′-二硫代-2-硝基苯甲酸)、TCA(三氯乙酸)、尿素(Urea)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、甘氨酸(Gly)、鹽酸胍、巰基乙醇等、四丁基氫氧化胺、四氫呋喃、甲基碘等 均為市售分析純。

膠體磨 江陰新諾粉體設備有限公司;XY-1型氧氣機 深圳宏鑫源電子有限公司;BT-9300S型激光粒度分布儀 丹東百特儀器有限公司;AA-240原子吸收分光光度計 美國Varian公司;LXJ-IIB離心機 上海安亭科學儀器廠;Sigma1-14微量高速離心機 德國Sigma公司;SH-1000紫外-可見分光光度計 日本Corona公司;Himac CR21G型冷凍干燥機 日本HITACHI公司;Quanta 200掃描電鏡 荷蘭Fei公司;MOS-450圓二色光譜儀 法國Biologic公司;傅立葉紅外光譜儀 美國Nicolet公司;250XI X射線光電子能譜儀 日本Shimadzu公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大米蛋白和米渣蛋白的制備

1.2.1.1 大米蛋白制備 大米用去離子水以1∶8的固液比,浸泡15 h后打漿,40 ℃條件下用2 mol/L的NaOH浸提2 h,浸提液4000 r/min離心15 min,取上清液,加2 mol/L的HCl調pH至5.5進行酸沉,然后在4 ℃靜置過夜,離心(4000 r/min,15 min),取沉淀,去離子水洗3次,再用0.5 mol/L的NaOH調pH至中性,4000 r/min離心15 min,取沉淀進行冷凍干燥,得大米蛋白[16],干燥保存備用。

1.2.1.2 米渣蛋白去雜 米渣用正己烷預先脫脂后干燥,脫脂米渣中加入去離子水,固液比1∶8,用1.0 mol/L的NaOH溶液調節提取液pH至6.0,加入1.0%高溫淀粉酶,90 ℃下反應1 h,冷卻后調pH至4.5,添加1.2%纖維素酶于55 ℃下反應2 h,冷卻至室溫,4000 r/min離心15 min,收集沉淀,去離子水洗3次,4000 r/min離心15 min,取沉淀物,冷凍干燥,得米渣蛋白[17],干燥保存備用。

1.2.2 原料大米、米渣及制備的大米蛋白、米渣蛋白中各組分的含量測定 蛋白質含量用凱氏定氮法測定[18];脂肪含量用索氏抽提法測定[19];灰分按國標GB 5009.4-2016[20]測定;粗纖維含量參考GB/T 5009.10-2003[21]測定;淀粉含量參考GB 5009.9-2016[22]中酸水解法測定;水分的測定參考GB 5009.3-2016[23]測定。

1.2.3 大米蛋白、米渣蛋白對鎘的結合能力試驗

1.2.3.1 蛋白質與鎘結合試驗 用氯化鎘配制100 mg/L的鎘溶液,取兩份1 L上述鎘溶液于1.5 L塑料瓶中,向鎘溶液中各添加大米蛋白和米渣蛋白5.0 g,在磁力攪拌器上攪拌混勻后,氣浴恒溫搖床內振蕩(180 r/min,25 ℃)反應。分別在蛋白樣品加入后的2、5、10、30、60、90、120、180、240、300和360 min時取樣0.5 mL,離心(10000 r/min,2 min),取上清液,稀釋到適宜的濃度,用原子吸收分光光度計測定溶液中鎘濃度。

1.2.3.2 鎘脫除試驗 已結合鎘的大米蛋白與米渣蛋白在-50 ℃條件下,冷凍干燥72 h后,作為鎘脫除試驗的樣品,用稀鹽酸溶液脫除,料液比1∶2,鹽酸濃度為0.04 mol/L,反應時間120 min、反應溫度25 ℃、分別在2、5、10、30、60、90、120和180 min取樣0.5 mL,離心(10000 r/min,2 min),取上清液,稀釋到適宜的濃度測定溶液中鎘濃度。

1.2.3.3 鎘結合量和鎘脫除率 計算公式如式(1)和(2)所示。

式(1)

式(2)

式(1)中,C0:氯化鎘初始濃度,mg/L;Ct1:取樣時試液中鎘濃度,mg/L;V1:反應體系的體積,L;m:加入蛋白樣品的質量,g;式(2)中,M:蛋白樣品中鎘的質量,mg;Ct2:取樣時試液中鎘濃度,mg/L;V2:反應體系的體積,L。

1.2.4 蛋白質粉末粒徑測定 粒徑測定用水做介質,背景校準后,取適量結合鎘前后的大米蛋白粉和米渣蛋白粉加入樣品池中,分散均勻后用粒度分布儀測定樣品的粒徑分布。

1.2.5 巰基及二硫鍵的測定 采用Ellman’s試劑比色法,用分光光度計在412 nm處測定吸光度,計算結合鎘前后的大米蛋白和米渣蛋白中巰基和二硫鍵的含量,具體方法參見Damodaran等[24]和張來林等[25]的測定方法。

1.2.6 蛋白質二級結構的測定 將樣品溶于0.05 mol/L、pH為7.5磷酸鹽緩沖液中,離心取上清液。圓二色光譜儀測定參數:遠紫外區190～250 nm范圍的光譜,蛋白質濃度為0.15 mg/mL,比色皿光徑0.1 cm,分辨率0.2 nm,譜帶寬度為1.0 nm,靈敏度20 mdeg,響應時間0.25 s,得CD譜圖。并用CDSSTR軟件分析蛋白質二級結構。

1.2.7 紅外光譜(FTIR)分析 將2 mg鎘結合前后的大米蛋白粉與米渣蛋白粉樣品,與適量溴化鉀混合,研磨數分鐘并用壓片機壓成透明小塊。然后,在分辨率2 cm-1、掃描范圍4000～400 cm-1、掃描次數32的條件下進行FTIR譜圖采集。最后,以溴化鉀作空白背景,進行結果校正[26]。

1.2.8 掃描電鏡(SEM)分析 分別取適量的結合鎘前后的大米蛋白、米渣蛋白樣品放置于導電膠上,固定后噴金,采用電子束對樣品進行微觀形貌拍攝,探針電壓為30 kV,電流為50 pA,電子束加速電壓為5 kV,放大倍數為20000倍[27]。

1.2.9 X射線光電子能譜(XPS)分析將結合鎘后的大米蛋白、米渣蛋白樣品干燥,并用結合鎘前的大米蛋白、米渣蛋白作為對照。使用Al Ka X射線源在0～1300 eV的電壓范圍內進行光譜掃描。

1.2.10 蛋白羧基及巰基在鎘結合中的作用

1.2.10.1 羧基的掩蔽 分別取10.0 g上述制備的兩種蛋白樣品于500 mL燒瓶中,加入34 mL的1 mol/L四丁基氫氧化胺、100 mL四氫呋喃和18 mL甲基碘,25 ℃下攪拌反應至pH試紙檢測不到堿性為止。抽真空過濾,用蒸餾水清洗過濾3遍。將甲基化的蛋白樣品置于50 ℃真空干燥箱24 h后,得到掩蔽羧基的蛋白樣品[28-29]。

1.2.10.2 巰基氧化 分別取10.0 g上述制備的兩種蛋白樣品,置于pH為8.0的去離子水中,磁力攪拌,向水溶液中持續通氧24 h,氧氣流量3 L/min。反應完成后,蒸餾水水洗過濾三次后,樣品置于50 ℃真空干燥箱24 h后,得到巰基氧化的蛋白樣品。

1.2.10.3 結合鎘試驗 分別用羧基被掩蔽的、巰基被氧化的大米蛋白和米渣蛋白做結合鎘試驗,方法參見1.2.3,蛋白與鎘結合試驗,并通過公式(1)計算蛋白與鎘的最大結合量。

1.3 數據分析

樣品進行3次平行試驗,結果用平均值±標準差的形式表示。用Origin 8.5軟件圖形化處理。

2 結果與分析

2.1 原料大米、米渣及制備的大米蛋白、米渣蛋白中基本成分的含量

樣品中各基本成分及含量如表1所示,米渣是大米淀粉糖廠生產淀粉糖之后的副產品,米渣來源于大米,在加工過程中,淀粉被脫除,因此蛋白質、脂肪、粗纖維等成分富集,尤其是蛋白質,米渣中的蛋白質含量達到54.58%。利用淀粉糖廠同一批次的大米原料和米渣制備得到的大米蛋白和米渣蛋白中蛋白質含量分別90.20%和88.40%,兩種蛋白樣品的純度相差僅為1.80%。

表1 不同樣品中各基本成分的含量Table 1 Contents of basic components in different samples

2.2 大米蛋白與米渣蛋白對鎘的結合能力分析

大米蛋白與米渣蛋白對鎘的結合量如圖1所示。由圖1可知,前30 min內米渣蛋白與鎘結合的曲線斜率大,表明米渣蛋白對鎘結合反應速率快,因為米渣蛋白結合位點多,所以初始反應速度快[30];30～90 min內,大米蛋白與鎘結合的曲線斜率大,表明大米蛋白的對鎘結合速率快,因為大米蛋白對鎘結合的累積量比米渣蛋白少,反應體系中剩余鎘離子濃度更高,鎘與大米蛋白結合的機會更多[31],所以這段時間內大米蛋白與鎘結合的速度快。大米蛋白在180 min內與鎘的結合接近飽和,對鎘的最大結合量為8.85 mg/g。米渣蛋白在300 min內與鎘的結合達到飽和,最大結合量為12.08 m/g。米渣蛋白與鎘結合達到最大時的反應時間較長,與米渣蛋白對鎘的結合量多有關[32]。

圖1 大米蛋白與米渣蛋白與鎘結合量隨時間的變化Fig.1 Effects of reaction time on the binding behavior of cadmium to rice proteins and rice dreg proteins

兩種已結合鎘的蛋白在稀鹽酸溶液中鎘的脫除率如圖2所示。由圖2可知,鹽酸對鎘的脫除效果較好,脫除率達93%以上。從脫除時間上看,大米蛋白結合的鎘在60 min內達到最大脫除率,米渣蛋白上結合的鎘則需要120 min才能達到最大脫除率,說明鎘在米渣蛋白中結合更牢固,脫除較難。綜合圖1～圖2的分析,米渣蛋白與鎘的結合能力比大米蛋白對鎘的結合能力更強。

圖2 大米蛋白與米渣蛋白的鎘脫除率隨時間的變化Fig.2 Effects of reaction time on the removal rate of cadmium from rice proteins and rice dreg proteins

2.3 大米蛋白和米渣蛋白的粒徑分布

大米蛋白和米渣蛋白的粒徑分布和粒徑參數如圖3和表2所示,大米蛋白的平均粒徑為51.98 μm,米渣蛋白的平均粒徑為75.53 μm。由于大米制糖過程中高溫液化引起的美拉德反應以及蛋白質中高含量的天冬酰胺和谷氨酰胺通過氫鍵等結合,會使蛋白質聚集[33],所以米渣蛋白的粒徑比大米蛋白的粒徑大。粒徑較小的大米蛋白擁有較大的比表面積,為0.144 m2/g,米渣蛋白的比表面積僅為0.081 m2/g,大米蛋白的比表面積比米渣蛋白大77.8%。大米蛋白的比表面積大,但是與鎘的結合量小,則比表面積不是影響鎘結合量的主要因素?？梢姷鞍着c鎘的結合不僅是簡單的物理吸附作用。與鎘結合后的大米蛋白和米渣蛋白的平均粒徑均增大,D50分別增加21.24、8.21 μm,可能因為鎘引起蛋白質顆粒聚集,導致了粒徑增加。

表2 結合鎘前后大米蛋白和米渣蛋白的粒徑參數Table 2 Particle size parameters of rice protein and rice dreg protein before and after cadmium bound

圖3 結合鎘前后大米蛋白和米渣蛋白的粒徑分布圖Fig.3 Size distribution of rice protein and rice dreg protein before and after cadmium bound

2.4 大米蛋白和米渣蛋白的巰基、二硫鍵及二級結構分析

結合鎘前后大米蛋白和米渣蛋白的CD圖譜如圖4所示,通過軟件計算出的二級結構含量如表3所示。從表3中數據得出,大米蛋白的α-螺旋含量(77.2%)較高,有序結構(α-螺旋、β-折疊、β-轉角)占84.6%,而米渣蛋白的(α-螺旋含量較低,為35.9%,與大米蛋白相比,其無規則卷曲結構顯著提高,含量為55.3%,有序結構含量明顯降低,僅占44.7%,這與趙殷勤等[17]的研究結果一致。米渣蛋白經過高溫變性,二級結構發生變化,有序結構向無序結構轉變,無序結構的增加會使得蛋白質結構變得松散[34],從而會暴露出一些基團,如巰基。表3中,米渣蛋白的巰基含量較高,比大米蛋白的巰基含量高35.9%。文獻報道,巰基(-SH)所含的硫原子的給電子能力強,易與金屬發生配位反應[35]。米渣蛋白中巰基含量高于大米蛋白的巰基含量,且前者對鎘的結合量高,結合的鎘較難脫除。此外,結合鎘后的大米蛋白和米渣蛋白的巰基含量均比結合鎘前降低,因此巰基的存在可能是米渣蛋白比大米蛋白對鎘的結合能力強的一個因素。結合鎘之后蛋白的二級結構發生變化,由α-螺旋向β-折疊轉變,這與Feng等[36]的研究結果一致。

表3 結合鎘前后大米蛋白和米渣蛋白的巰基、二硫鍵及二級結構含量變化Table 3 Changes of content of sulfhydryl,disulfide bond and secondary structure of rice protein and rice dreg protein before and after cadmium bound

圖4 結合鎘前后的大米蛋白和米渣蛋白的CD圖譜Fig.4 CD map of rice protein and rice dreg protein before and after cadmium bound

2.5 紅外光譜(FTIR)分析

大米蛋白較大的比表面積并沒有使其對鎘的結合量變大,說明鎘與蛋白的結合不是簡單的物理吸附作用,與鎘的結合可能是蛋白質上的結合位點的作用。因此對與鎘結合前后的兩種蛋白質做FTIR分析,紅外圖譜如圖5所示。

圖5 與鎘結合前后的大米蛋白和米渣蛋白的紅外光譜圖Fig.5 FTIR of of rice protein and rice dreg protein before and after cadmium bound

蛋白質酰胺Ⅰ帶(C=O伸展振動)和酰胺Ⅱ帶(N-H彎曲振動與C-N伸展振動疊加)吸收峰出現在1655～1555 cm-1處[37],圖5中結合鎘之后,兩種蛋白的酰胺Ⅱ帶峰位發生移動(1555～1510 cm-1),說明酰胺基團起作用。雖然制備得到的兩種樣品的蛋白純度不是100%,但是結合鎘的是酰胺基團,由此得出與鎘結合的不是淀粉、纖維素等其他物質,而是蛋白質。蛋白質N-H或O-H的伸縮振動吸收峰出現在3750～3000 cm-1處。比較結合鎘前后兩種蛋白質的峰位,在3301 cm-1處,峰位發生紅移,說明O原子參與鎘的結合,導致O-H鍵長增加,O-H的伸縮振動向低波數移動41 cm-1。此外,C=O的吸收峰在1654 cm-1處由銳鋒變成鈍峰,C-O的吸收峰在1415 cm-1處發生紅移,峰的變化是由于蛋白質上的-COOH與鎘結合后減少了-COOH含量[38],因此蛋白在與鎘的結合過程中羧基具有重要作用。

2.6 掃描電鏡(SEM)結果

與鎘結合前后的大米蛋白與米渣蛋白微觀形態如圖6所示。由圖6可知,兩種蛋白質結合鎘后均出現聚集現象,由于蛋白上的結合位點被鎘結合之后,表面電荷發生變化,分子間靜電斥力減小[39],導致大米蛋白顆粒的聚集,這與粒徑的測定結果一致。與鎘結合后的米渣蛋白表面變成了連續凹凸不平、不規則、多層次的片狀結構,說明鎘在米渣蛋白的表面發生結合。大米蛋白在結合鎘前后,微觀形貌未見明顯變形,米渣蛋白與鎘結合后微觀形態發生變化,形態的變化有可能是鎘導致米渣蛋白發生變性,結構發生變化。這與翟齊嘯研究結果類似,鎘會導致乳酸菌表面蛋白變性,使得乳酸菌出現凝結和聚集現象[8]。

圖6 蛋白與鎘結合前后SEM圖(1200×)Fig.6 SEM of protein before and after cadmium bound(1200×)注:(A)和(B)分別表示與結合鎘前后的大米蛋白,(C)和(D)分別表示與結合鎘前后的米渣蛋白。

2.7 X射線光電子能譜(XPS)分析

大米蛋白和米渣蛋白結合鎘前后的XPS圖譜如圖7所示。由圖7可知,結合能在163.8 eV位置是巰基的出峰位置,圖(A)和(B)中觀察出,大米蛋白與米渣蛋白結合鎘后,巰基峰值強度均變弱,表明鎘與蛋白的巰基結合后,降低了巰基含量[40]。結合能在404～405 eV和411～412 eV位置是鎘出峰位置,圖(C)和(F)中表明,大米蛋白和米渣蛋白上均結合了鎘,且與大米蛋白相比,米渣蛋白中鎘的峰值較大,表明米渣蛋白對鎘的結合量大[41-42],這與實驗1.2.3的結果一致。

圖7 蛋白與鎘前后X射線光電子能譜圖Fig.7 XPS of protein before and after cadmium bound注:(A)、(B)、(C)分別表示大米蛋白與鎘結合前后的巰基峰、全波段掃描峰、鎘峰; (D)、(E)、(F)分別表示米渣蛋白與鎘結合前后的巰基峰、全波段掃描峰、鎘峰。

2.8 蛋白質羧基、巰基對鎘結合的作用

掩蔽羧基、氧化巰基后的兩種蛋白與鎘的最大結合量與各自未處理的蛋白相比,對鎘結合量顯著性降低(p<0.05),結果如圖8所示。羧基被甲基化,氫原子被置換,從而失去了離子交換的能力,這種處理后,大米蛋白和米渣蛋白對鎘的最大結合量與各自未被處理的蛋白均減小,均降低18%。這與翟齊嘯[8]的研究結果一致。巰基被氧化后,大米蛋白和米渣蛋白與各自未被處理的蛋白相比,對鎘的最大結合量分別降低40%和50%。因為硫元素最外層電子排布是3s23p4,因此蛋白質巰基上的硫外層豐富的孤對電子導致它具有很強的親核性,易與金屬陽離子發生配位反應[43]。當巰基被氧化后,親核性降低,與鎘結合量降低。

圖8 大米蛋白和米渣蛋白質羧基、巰基對鎘結合量的影響Fig.8 Effects of carboxyl and sulfhydryl groups on maximum cadmium binding capacity of rice protein and rice dreg protein注:不同小寫字母表示差異性顯著(p<0.05)。

3 結論

與大米蛋白相比,米渣蛋白對鎘的最大結合量為12.08 mg/g(大米蛋白對鎘的最大結合量為8.85 mg/g),且被米渣蛋白結合的鎘,用稀鹽酸脫除所需時間長,脫除相對較難,因此米渣蛋白對鎘的結合能力更強。XPS圖譜、蛋白質粒徑分布及羧基掩蔽、巰基氧化等試驗結果表明,兩種蛋白對鎘的結合不僅是簡單的物理吸附過程,與大米蛋白相比,米渣蛋白二級結構發生變化,無序結構增加,且暴露出更多的巰基。在對鎘的結合過程中,巰基、羧基起著重要作用,尤其是巰基對鎘的結合作用強。另外,結合鎘后會引起蛋白質相互聚集。以上研究為大米蛋白和米渣蛋白吸附鎘的研究和應用提供了依據。