乙?；到夂Ф嗵堑目寡趸?、吸濕/保濕性能探究

蔡婉靜,劉少偉,李 苒,秦 天,施曉予

(華東理工大學生物工程學院,國家生物反應器重點實驗室,上海 200237)

海帶由于極易形成藻類生態系統,早已達到大規模的商業種植規模,其在東南亞地區的產量尤為豐富。據報道,至2016年底,我國的海帶年產量已高達140余萬噸[1],占據我國海藻養殖面積的31%。其富含硫酸多糖,又被稱為褐藻糖膠,是海帶主要的生物活性成分之一。海帶多糖獨特的硫酸根成分賦予其特殊的抗氧化、抗凝血、抗病毒能力。Peng等[2]的研究表明,從海帶提取的多糖表現出顯著的羥自由基和超氧自由基清除能力,將其制成天然的抗氧化劑或功能性食品原料,具有及其廣闊的市場前景。

據相關研究表明,海帶多糖的生物活性與其分子量、基團種類、硫酸基含量和多糖結構密切相關[3]。改性修飾可以改變多糖的結構構象及其基團種類,從而改善其生物活性[4]。根據原理,多糖的改性修飾可分為兩類[5]:一種是通過物理或化學降解改變多糖的分子量大小,另一種是通過化學修飾引入新的官能團,從而改變其基團種類。目前,對海帶多糖改性常采用單一方法改性,只改變海帶多糖的分子量或者基團種類,這種改性方式受其原理限制,對多糖生物活性的提升效果有限,而采用降解和引入基團兩種改性方式聯合處理的改性研究目前尚未見報道。

為提高海帶多糖的抗氧化活性及吸濕/保濕能力,本文將超聲降解和醋酸酐法改性結合,聯合處理得到乙?；到夂Ф嗵?并對多糖體外抗氧化劑和吸濕/保濕活性進行測定比較,以期開發一款優質的食品抗氧化劑及生物美容原料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海帶 購買自中國福建當地的農貿市場;乙醇、醋酸酐、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、苯酚、氯化鋇、三氯乙酸、明膠、硫酸鉀、葡萄糖、過氧化氫、硫酸亞鐵、水楊酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、過硫酸銨、碳酸鈉 均為分析純,上海泰坦化學試劑有限公司;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) TCL化成工業發展有限公司;甘油 上海凌峰化學試劑有限公司。

DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱 齊欣科學儀器(上海)有限公司;DL-5-B離心機 上海安亭科學儀器廠;YB700-B多功能高速粉碎機 永康市鉑歐五金制品有限公司;旋轉蒸發儀 上海申生科技有限公司;CP214C電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;85-2恒溫磁力攪拌器 馳久儀器(上海)有限公司;UV-2000紫外可見分光光度計 尤尼克儀器(上海)有限公司;FE-20精密pH計 奧豪斯儀器(常州)有限公司;NDJ-8S自動粘度儀 捷護儀器(上海)有限公司;S-3400N SEM掃描電鏡 日立儀器(日本)有限公司;KH-250B超聲清洗儀 昆山禾創超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乙?；到夂Ф嗵堑闹苽?/p>

1.2.1.1 海帶多糖的制備 采用水提醇沉法[6]制備海帶多糖。將海帶在80 ℃下熱風干燥2 h,磨粉后過60目篩。將海帶粉與蒸餾水按1∶50的料液比混合,80 ℃水浴條件下震蕩提取4 h。提取結束后3500 r/min離心15 min,取上清液,減壓濃縮至原體積1/3,加入95%乙醇直至溶液中乙醇濃度為30%,靜置過夜(12 h)后3500 r/min離心15 min取上清液。在上清液中加入95%乙醇至溶液中乙醇濃度為70%,離心取沉淀,用95%乙醇充分洗滌后,于烘箱中50 ℃熱風干燥至恒重,即得海帶多糖(LP)。

1.2.1.2 降解海帶多糖的制備 稱取2 g LP,充分分散于200 mL蒸餾水中。將混合均勻的多糖溶液轉移至300 mL錐形瓶中,將錐形瓶置于超聲清洗儀中,在水浴溫度50 ℃、功率150 W的條件下超聲處理4 h。超聲處理結束后,待其冷卻至室溫,旋轉蒸發濃縮至原體積1/3,按1.2.1.1醇沉、離心、洗滌、烘干后,即得降解海帶多糖(DLP)。

1.2.1.3 乙?；到夂Ф嗵堑闹苽?采用醋酸酐法[7]制備乙?；到夂Ф嗵?。稱取2 g DLP,將其分散于200 mL NaOH溶液(pH=9.0)中,待多糖充分溶解后,分4次加入80 mL醋酸酐,在加入過程逐滴加入NaOH溶液(pH=9.0),控制反應液pH在8.0～8.5之間。將反應液在磁力攪拌條件下充分攪拌20 min,而后置于40 ℃水浴條件下反應2 h。反應結束后,待反應混合液冷卻至室溫后,逐滴加入HCl溶液(1.0 mol/L)直至反應液pH至7.0。3500 r/min離心10 min除去不可溶物質后,將所得上清液經濃縮、醇沉、離心、多次洗滌、干燥后,制備得到乙?；到夂Ф嗵?ADLP)。

1.2.2 多糖化學組成測定 總糖含量采用苯酚-硫酸法測定[8],標準曲線:Y=11.649X+0.0092(R2=0.9991)。硫酸基團含量采用明膠-氯化鋇法測定[9],標準曲線:Y=0.6117X+0.3633,(R2=0.9993)。乙?；〈葴y定采用中和滴定法[10],取代度(DS)計算公式如下:

式(1)

其中,W為多糖樣品中乙?；鶊F含量。

1.2.3 理化性質測定

1.2.3.1 溶解能力測定 多糖的溶解能力測定參照Kong等[11]提出的方法,以多糖完全溶解所需時間表征。量取50 mL蒸餾水置于燒杯中,加入0.01 g多糖樣品,將混合物置于磁力攪拌器上攪拌溶解(150 r/min),直至多糖最終完全溶解。

1.2.3.2 相對粘度測定 多糖溶液相對粘度的測定參照Wu[12]提出的方法。使用自動粘度儀分別測定樣品液(1 mg/mL)和去離子水的粘度,相對粘度即為樣品溶液粘度和去離子水粘度的比值。

1.2.3.3 pH測定 將多糖配制成1 mg/mL的溶液,在室溫條件下(25～30 ℃)使用FE-20精密pH計測定樣品液pH。

1.2.4 表觀結構觀測 多糖樣品的表觀結構采用S-3400N SEM掃描電鏡進行測量。將多糖樣品用研缽研碎后,用導電膠粘貼于鋁制置樣臺之上,噴金后進行電鏡檢測。

1.2.5 抗氧化能力測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測定 DPPH自由基清除能力的測定參照Cheng等[13]使用的方法,并采用常用抗氧化劑維生素C作為陽性對照。各取2 mL不同濃度的多糖待測液及維生素C溶液加入試管,再加入2 mL DPPH自由基反應液(6 mmol/L),混合均勻后于25 ℃避光條件下反應30 min,在517 nm處測定吸光度。以2 mL甲醇與2 mL DPPH自由基反應液的混合液作為對照實驗;2 mL甲醇與2 mL待測樣品液的混合液作為空白實驗。DPPH自由基清除率按以下公式計算得到:

式(2)

式中:A1-待測樣品吸光度值;A2-空白實驗組吸光度值;A0-對照實驗組吸光度值。

1.2.5.2 羥基自由基清除能力測定 羥基自由基清除能力按照Yue等[14]使用的方法,并在此基礎上進行少量改動。各取2 mL不同濃度的多糖待測液,依次加入2 mL FeSO4溶液(6 mmol/L)、2 mL水楊酸溶液(6 mmol/L)、2 mL過氧化氫溶液(6 mmol/L),混合均勻后于37 ℃水浴條件下反應30 min,在510 nm處測定吸光度。將蒸餾水替代多糖樣品溶液的反應液作為對照組,蒸餾水替代水楊酸的反應液作為空白組。羥基自由基清除率按照下式進行計算:

式(3)

其中:A1-待測樣品吸光度值;A2-空白實驗組吸光度值;A0-對照實驗組吸光度值。

1.2.5.3 總還原能力測定 總還原能力的測定參照Cheng等[13]使用的方法,并進行了部分改動。分別吸取2 mL不同濃度的待測多糖溶液,加入0.5 mL磷酸緩沖液(pH=7.4)、1.5 mL鐵氰化鉀(0.3%),混合均勻后置于50 ℃水浴條件下反應10 min。反應完成后,取出2 mL反應液置于不同試管中,加入0.5 mL三氯化鐵溶液,靜置反應5 min后,于700 nm波長處測定吸光度。將蒸餾水替代磷酸緩沖液、鐵氰化鉀、三氯化鐵的反應液作為空白組。

1.2.6 吸濕/保濕能力測定 參考Li等[15]在研究中采用的方法,并以常用保濕劑甘油[16]作為陽性對照。

1.2.6.1 吸濕能力測定 取0.100 g待測多糖樣品、甘油置于扁形稱量瓶中,將其放入置有飽和硫酸銨溶液(RH81%)和飽和碳酸鈉溶液(RH43%)的干燥器內,室溫下放置,并在2、4、8、12、24、36 h后測定樣品重量。吸濕能力按照公式(4)計算:

式(4)

其中:Wn-不同時間段樣品的重量;W0-樣品的初始重量。

1.2.6.2 保濕能力測定 取0.100 g待測多糖樣品、甘油置于扁形稱量瓶中,并分別加入樣品質量3倍的去離子水,轉動稱量瓶直至樣品將水分完全吸收。將稱量瓶放入裝有干燥完全的硅膠的干燥室內(RH,10%),于室溫下放置,并在2、4、8、12、24、36 h后測定樣品重量。保濕能力按照公式(5)計算:

式(5)

其中:Wn-不同時間段樣品的重量;W0-含水樣品的初始重量。

1.3 數據處理

實驗數據結果采用Excel 2013和SPSS 21軟件處理。每組實驗設置三個平行樣本,實驗結果以實驗數據均值(Mean)±標準差(SD)的形式表示。數據的顯著性差異檢驗采用t檢驗法。

2 結果與分析

2.1 多糖化學組成及理化性質分析結果

2.1.1 多糖化學組成分析 如表1所示,隨著改性進程的逐步深入,多糖樣品的總糖含量逐步減少,說明超聲降解及乙?；男蕴幚碓斐闪硕嗵擎湹牟糠纸到鈁17],從而引起多糖樣品中的總糖含量降低。經過超聲降解處理過后,ADLP、DLP的硫酸基團含量較LP略有上升,這可能是因為乙?；男约俺暯到饬瞬糠侄嗵?，且幾乎沒有破壞海帶多糖的硫酸基團。ADLP的乙?；鶊F取代度(DS)達0.360,表明醋酸酐法已成功將乙?；鶊F引入DLP中。

表1 三種多糖樣品的主要成分分析Table 1 Main component analysis of three polysaccharide samples

2.1.2 理化性質分析 由圖1可看出,LP、DLP、ADLP的水溶液pH分別為5.51±0.01、6.20±0.01、6.51±0.01,表明三種多糖均為中性物質,且在弱酸性溶液中穩定。LP、DLP、ADLP的溶解所需時間分別為(6.52±0.03)、(4.97±0.09)、(0.841±0.01) min(圖1),表明降解及乙?；男跃芴岣吆Ф嗵堑娜芙饽芰?同時,DLP和ADLP溶解能力的提高,暗示其生物活性能力也會相對應的提升[18]。LP、DLP以及ADLP的相對粘度值分別為(1.567±0.030)、(1.435±0.006)、(1.153±0.003)(如圖1),ADLP的相對粘度為三者中最低。多糖的相對粘度與其分子鏈長度、柔韌性、以及分子鏈內部的相互作用力有關[19],較低的相對粘度間接表明ADLP的分子鏈長度是最低的,這一方面歸功于ADLP的部分多糖鏈被乙?；噭┙到?另一方面是因為乙?；鶊F的引入導致多糖鏈的充分伸展,導致多糖粘度下降[20]。

圖1 海帶多糖樣品的溶解能力、pH及相對粘度Fig.1 Solubility,pH and relative viscosity of Laminaria japonica polysaccharide samples

2.1.3 表觀/微觀形態分析 由圖2可以看出,LP、DLP在外觀形態上都呈現不規則的塊狀形態,且兩者的表面都較為光滑,DLP比LP稍顯松散一些;相較于LP、DLP的塊狀形態,ADLP呈現更為松散的粉末形態。三種多糖樣品的掃描電鏡圖如圖3所示,在放大5000倍的情況下,LP的表面呈現光滑橢圓形態,并粘附有少量較小的LP;DLP的表面較LP更為粗糙,表明超聲降解處理成功降解了部分多糖;而ADLP的表面更為粗糙并且呈現一定的孔狀結構,這使得其具有更優異的水溶性以及更大的比表面積,并使多糖鏈中的活性基團能充分暴露并與自由基接觸反應,從而提升了多糖的生物活性[21];與LP相比較，未經改性處理的LP,其表面更為光滑,且不具有多孔結構,這與其較低的水溶能力以及較高的相對粘度相一致。

圖2 海帶多糖樣品的表觀圖像Fig.2 Photograph of Laminaria japonica polysaccharide samples注:A-海帶多糖LP;B-降解海帶多糖DLP;C-乙?；到夂Ф嗵茿DLP；圖3同。

圖3 海帶多糖樣品的掃描電鏡圖(5000×)Fig.3 SEM images of Laminaria japonica polysaccharide samples(5000×)

2.2 抗氧化性能分析結果

以三種多糖為研究對象,并以常用抗氧化劑維生素C為陽性對照,利用DPPH自由基、羥基自由基、總還原能力反應體系評估三種多糖樣品的抗氧化能力。

2.2.1 DPPH自由基清除能力 從圖4可以看出,除LP外,其他幾種樣品對DPPH自由基清除率的影響均隨樣品濃度的增加呈現一定的劑量效應關系,即抗氧化能力隨著濃度的升高而逐漸提高。如表2所示,根據擬合的回歸方程,計算各樣品的半數抑制率IC50,IC50越小表示其抗氧化能力越強。結果顯示,DLP、ADLP DPPH自由基清除能力的IC50分別為9.070、6.060 mg/mL,由此可知,在一定的濃度范圍內,三種多糖對DPPH自由基清除能力從大到小依次為:ADLP>DLP>LP,但三種多糖的DPPH自由基清除能力均弱于抗氧化劑維生素C。

圖4 海帶多糖樣品對DPPH自由基的清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging abilities of Laminaria japonica polysaccharide samples

表2 海帶多糖樣品的抗氧化能力評價Table 2 Evaluation of antioxidant capacities of Laminaria japonica polysaccharide samples

LP及ADLP的DPPH自由基清除能力均強于普通海帶多糖LP,說明超聲降解及乙?；幚砭捎行嵘Ф嗵堑目寡趸钚?。降解處理可使多糖鏈降解,增加了多糖鏈數量,使得多糖鏈末端的還原端數量增多,從而提升了多糖的供氫能力，這與Xu等[22]以黑醋栗降解多糖為研究對象的實驗結果相一致。此外,改性引入的乙?；芑罨嗵擎溨械漠愵^碳,使得多糖的供氫能力提升,繼而提升ADLP的DPPH自由基清除活性[23]。

2.2.2 羥基自由基清除能力 從圖5中可以看出,三種海帶多糖的羥基自由基清除活性也呈現比較明顯的劑量效應關系。DLP、ADLP的IC50分別為7.159、4.808 mg/mL(表2),表明三種多糖對·OH自由基的清除活性從高至低依次為ADLP、DLP、LP,其中ADLP在溶液濃度為9 mg/mL時,其羥基自由基清除活性高達84.75%,但三種多糖的羥基自由基清除活性均低于維生素C(p<0.05)。

圖5 海帶多糖樣品對羥基自由基的清除能力Fig.5 Hydroxyl radical scavenging abilities of Laminaria japonica polysaccharide samples

實驗結果表明,降解及乙?；^程均能有效提升海帶多糖的羥基自由基清除活性,這與在DPPH自由基清除活性實驗中觀測得到的結果一致。羥基自由基的清除主要有兩種機制[24]:(a)清除羥基自由基:抗氧化劑通過提供氫(H)離子將羥基自由基還原;(b)抑制羥基自由基產生:抗氧化劑與能活化H2O2的過渡金屬離子(如Fe2+)螯合,從而抑制Fenton反應中羥基自由基的產生。超聲降解處理提升海帶多糖的羥基自由基清除活性,可能是由于降解處理使得多糖鏈斷裂,使得多糖鏈末端的還原端數量增加,從而提升多糖的羥基自由基清除能力。而乙?；幚硖嵘Ф嗵堑牧u基自由基清除活性的機制,則可能是由于改性引入的乙?；鶊F能與Fe2+離子螯合,抑制H2O2活化,從而抑制羥基自由基的產生,這與Shao等[25]在對滸苔多糖進行乙?；男院笥^測得到的結果一致。

2.2.3 總還原能力 從圖6可看出,三者的總還原能力同樣呈現明顯的劑量效應關系。當樣品濃度達9 mg/mL時,LP、DLP、ADLP的吸光度分別達到1.174、1.237、2.207?？傮w來說,三種海帶多糖的總還原能力從大到小依次為ADLP>DLP>LP,且ADLP的總還原能力顯著高于DLP與LP(p<0.05),而DLP與LP的總還原能力沒有顯著差異(p>0.05)。

圖6 海帶多糖樣品的總還原能力Fig.6 Reducing power of Laminaria japonica polysaccharide samples

實驗結果表明,超聲降解對于多糖的總還原能力沒有太大影響,而乙?；男钥梢杂行岣叨嗵堑目傔€原能力。這主要是因為乙?；鶊F的引入使得多糖鏈結構變得更為舒展[26],賦予其更加優異的水溶性從而能在更高濃度條件下發揮生物活性;另一方面,更為舒展的結構使得多糖鏈中的活性基團(如羥基)得到充分暴露,從而能與自由基充分接觸通過供氫作用達到還原效果[27]。

2.3 吸濕/保濕能力結果分析

2.3.1 吸濕能力 多糖的吸濕能力如圖7所示。樣品在兩種濕度條件下的吸濕能力均表現一致,從大到小依次為甘油>DLP>ADLP>LP。在低濕度(RH43%)條件下,所有多糖樣品的吸濕率都在前12 h內迅速上升,并在12 h后逐漸達到平衡,達到平衡后,LP、DLP、ADLP及甘油的吸濕率分別為15.67%、19.33%、17.67%、28.67%;而在高濕度(RH81%)條件下,所有多糖樣品吸濕率則在24 h后達到飽和狀態,LP、DLP、ADLP及甘油在飽和狀態下的吸濕率分別為21.00%、27.33%、26.33%、50.33%,ADLP的吸濕率比LP高出25.4%,表明ADLP較LP具有良好的吸濕能力。

圖7 海帶多糖樣品的吸濕能力(A-RH43%,B-RH81%)Fig.7 Moisture absorption capacities of Laminaria japonica polysaccharide samples(A-RH43%,B-RH81%)

實驗結果顯示,DLP和ADLP的吸濕能力顯著高于LP(p<0.05),表明超聲降解和乙?；男跃苡行г鰪姾Ф嗵堑奈鼭裥?。這一方面歸功于超聲降解處理能有效降低海帶多糖的分子量,增加海帶多糖鏈末端的吸收位點數量,從而增強其吸濕能力[28]。另一方面,這可能是由于乙?；男砸氲囊阴；鶊F能與水形成氫鍵,從而提升海帶多糖的吸濕能力[25]。

2.3.2 保濕能力 從圖8中可以看出,三種多糖樣品和甘油在硅膠干燥環境(RH 10%)下,其保濕率在前12 h內均迅速下降,在12 h后下降速度明顯變緩,并于24 h后達到平衡。在24 h后,LP、DLP、ADLP、甘油的保濕率分別為51.56%、53.51%、43.85%、42.19%。四者的保濕能力從大到小依次為DLP>LP>ADLP>甘油,三種多糖樣品的保濕能力均優于甘油。結果表明,超聲降解能有效提升海帶多糖的保濕能力,而乙?；男詫Ф嗵潜衲芰β杂邢陆?。這可能是由于改性過程中使用的乙?；噭┢茐牧撕Ф嗵堑牟糠秩S結構,從而導致其持水能力下降[29]。

圖8 海帶多糖樣品的保濕能力(RH10%)Fig.8 Moisture retention capacities of Laminaria japonica polysaccharide samples at RH 10%

3 結論

本文采用超聲降解及乙?；男月摵咸幚砗Ф嗵?成功制備得到乙?；到夂Ф嗵茿DLP,并探究其抗氧化能力、吸濕/保濕能力變化。結果顯示ADLP的抗氧化能力明顯高于LP及DLP,表明超聲降解及乙?；男月摵咸幚砜捎行嵘Ф嗵堑捏w外抗氧化能力。此外,ADLP表現出良好的吸濕/保濕能力,其吸濕能力優于普通海帶多糖LP,保濕能力優于常用保濕劑甘油。研究結果表明,經由超聲降解和乙?；男月摵咸幚淼玫降腁DLP是一種可被應用于食品保存或是生物美容的潛在待開發物質。