硬毛粗蓋孔菌產漆酶條件優化及其對日落黃的降解作用

宋麗麗,張志平,王光路,楊 旭,張靖楠

(鄭州輕工業學院食品與生物工程學院,河南鄭州 450002)

漆酶(Laccase,ρ-diphenoloxidase,EC1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶,廣泛存在于植物、動物、昆蟲、細菌和真菌中,漆酶通過獲得O2催化鄰對位苯二酚、多酚、對苯二胺、抗壞血酸等物質的氧化,使之生成相應的苯醌和水[1-3]。由于漆酶具有廣泛的底物專一性,可催化多種芳香族化合物,在造紙工業、環境保護、食品工業、生物傳感器、生物監測等領域應用廣泛[4]。在食品工業中,漆酶主要在果汁加工、葡萄酒釀造、面粉改良、食用菌栽培、食品檢測、食品廢水處理等方面具有重要的應用價值,是當今研究的熱點[5]。關于漆酶的研究多集中于擔子菌門(Basidiomycete)的白腐真菌(White rot fungi),而真菌漆酶活性受到多種條件的影響[6]:碳源或氮源的種類及濃度;金屬離子的種類及濃度(如Cu2+);誘導物,如藜蘆醇、阿魏酸等;培養條件,如溫度和pH;菌株特性等。盡管自然界中漆酶分布廣泛,但高產漆酶菌株并不多,通過優化培養條件提高漆酶產量仍然是主要的研究手段[7]。

食用合成色素從結構上可以分為偶氮類和非偶氮類兩類,我國食品添加劑使用衛生標準批準使用的偶氮類色素主要有檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅等[8]。日落黃又名晚霞黃、夕陽黃、食用色素3號、橘黃等,其分子結構見圖1,日落黃作為一種人工合成食品添加劑,被廣泛應用于食品、化妝品和藥物的著色[9]。由于日落黃具有耐熱、耐光性強,難于自然降解,且偶氮類合成色素多分子中含有偶氮鍵和芳香環,如超量違規使用則對人體造成危害[10]。因此需尋求高效綠色降解方法,以減少偶氮類合成色素對人體的傷害及對環境的污染。

圖1 日落黃的分子結構式Fig.1 Molecular structure of sunset yellow

硬毛粗蓋孔菌(Funaliatrogii)屬于非褶菌目多孔菌科粗毛蓋孔菌屬,產漆酶活力較強,在漆酶資源開發、染料脫色等方面具有較大的應用前景[11-12]。本文以硬毛粗蓋孔菌為出發菌株,研究培養基組成及培養條件對該菌產漆酶活性的影響,并研究漆酶粗酶液對合成色素日落黃的降解,對今后漆酶資源在食品行業開發具有重要的理論意義和廣泛的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硬毛粗蓋孔菌(F.trogii)菌株 由鄭州輕工業學院生物能源與系統生物學研究室提供;2,2′-聯氨-雙-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、偶氮合成色素日落黃(Sunset yellow) 購于美國Sigma公司;葡萄糖、乳糖、氯化銨、酒石酸銨、硫酸銅、曲酸等 購于國藥集團化學試劑有限公司;馬鈴薯瓊脂培養基(PDA培養基),馬鈴薯肉湯培養基(PDB培養基) 購于北京奧博星生物技術有限責任公司;基礎產酶培養基(g/L):葡萄糖20,NH4Cl 2.5,K2HPO43,MgSO4·7H2O 0.2,pH自然,121 ℃滅菌20 min。

UV-1800雙光速紫外-可見光光度計 上海欣茂儀器有限公司;SW-CJ-1D凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;LRH-1500F生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;QYC-2012C恒溫搖床 上海?，攲嶒炘O備有限公司;LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液的制備 將斜面菌株接種到PDA平板中,28 ℃下培養至菌絲體長滿整個平板(約7 d),用無菌打孔器取3塊接種塊(直徑1cm)接入PDB培養基中,150 r/min、28 ℃培養5 d,為一級種子液。

1.2.2 硬毛粗蓋孔菌液體發酵產漆酶 將5 mL一級種子液接入100 mL已滅菌的基礎產酶培養基(100 mL/250 mL)中,28 ℃、150 r/min條件下,培養12 d,期間對漆酶活性峰值進行監測,以確定最佳發酵時間,進行后續實驗。

1.2.3 漆酶粗酶液制備 發酵產酶結束后,取發酵液,8000 r/min、4 ℃離心10 min,上清液即為漆酶粗酶液。經適當稀釋后測定其漆酶活性。

1.2.4 漆酶活力的測定 反應體系為1.5 mL適當稀釋(使吸光度范圍為0.2～0.8)的粗酶液和1.5 mL ABTS(50 mmol/L,pH4.8)在420 nm處室溫下測定吸光度,每15 s記錄一個數據,測定3 min內反應液的吸光度變化[13]。漆酶(Lac)酶活定義為每分鐘轉化底物的μmol數(ε420=3.6×104L/mol/·cm)為一個酶活力單位(U)。酶活以U/mL表示。

1.2.5 生物量的測定 以菌絲體干重表示,發酵液經8000 r/min室溫離心10 min、蒸餾水洗滌后收集菌絲體,置70 ℃烘箱中干燥48 h至恒重(以g/L表示)[14]。

1.2.6 漆酶發酵條件選擇

1.2.6.1 最適碳源的選擇 基礎產酶培養基中分別以20 g/L乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘油、可溶性淀粉、玉米淀粉替代葡萄糖作為唯一碳源,培養基其它成分不變,將5 mL一級種子液接入基礎產酶培養基中,28 ℃、150 r/min搖床培養,以1.2.2實驗確定發酵時間為8 d,測定發酵液漆酶酶活。在確定最適碳源的基礎上,分別比較不同濃度(5、10、15、20、25、30、35 g/L)碳源添加量對菌體產漆酶的影響。

1.2.6.2 最適氮源的選擇 基礎產酶培養基中分別以2.5 g/L酒石酸銨、硝酸鉀、尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏替代氯化銨為唯一氮源,培養及測定條件同1.2.6.1。在確定最適氮源的基礎上,分別比較不同濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L)氮源添加量對菌體產漆酶的影響。

1.2.6.3 Cu2+及誘導劑的選擇 在確定碳、氮源種類及含量的基礎上,在培養基中加入CuSO4,分別調節培養基中Cu2+終濃度為0.0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mmol/L,測定漆酶酶活。選擇鄰苯二酚、藜蘆醇、香蘭素、愈創木酚、阿魏酸作為誘導劑,發酵第3 d加入培養基,控制其終濃度均為1 mmol/L,測定漆酶酶活。培養及測定條件同1.2.6.1。

1.2.6.4 最適培養條件的選擇 在確定培養基組成的基礎上,調節培養溫度分別為26、28、30、32、34、37 ℃,150 r/min搖床培養8 d,測定發酵液漆酶酶活;調節培養基初始pH3、4、5、6、7、8、9,30 ℃,150 r/min搖床培養8 d,測定發酵液漆酶酶活;調節搖床轉速分別為0(靜置培養)、50、100、150、200、250、300 r/min,培養基初pH為6,30 ℃培養8 d,測定發酵液漆酶酶活。

1.2.7 漆酶粗酶液對日落黃的降解 以1.2.6確定的漆酶最適發酵培養基組成及發酵條件的基礎上,參考徐春燕等[15]實驗方法,研究漆酶粗酶液對日落黃的降解影響。其中降解反應體系為200 U/mL粗酶液,50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.8),日落黃濃度分別為50、100、200、400、600、800 mg/L。30 ℃恒溫靜置避光反應,分別在反應的第0、0.5、1、2、3、5、10、24 h測定日落黃在其最大吸收波長處的吸光值。日落黃脫色率按如下方法計算:

式中,A0為對照的吸光度,At為反應t小時后樣品的吸光度。以滅活的酶液為對照。

1.2.8 漆酶介體及抑制劑對日落黃降解的影響 分別選擇100和600 mg/L日落黃作為底物終濃度,在反應體系中添加200 μL 10 mmol/L ABTS,其它條件同1.2.7,對比漆酶與漆酶-介體系統對日落黃的脫色情況。在漆酶粗酶液中添加曲酸,使其終濃度分別達到0、10、20、30、40、50、100 mmol/L,測定在該濃度下漆酶酶活;取被不同濃度曲酸抑制的漆酶粗酶液,日落黃底物濃度為100 mg/L,測定漆酶對日落黃的脫色情況,反應條件同1.2.7。

1.3 數據處理

實驗平行3次,采用Origin 8.0軟件進行數據處理及作圖。

2 結果與分析

2.1 硬毛粗蓋孔菌的生長曲線及產酶曲線

如圖2所示,在基礎產酶培養基中,隨著培養時間的延長,生物量逐漸增加,在7～10 d生物量基本穩定,此后菌體生物量逐漸降低,推測是由于培養基中營養成分耗盡,菌體自溶導致。在菌體培養初期(0～4 d),生物量快速增加,而漆酶活力較低(<5 U/mL),漆酶本身作為一種誘導酶,其分泌及活性受到菌體生長及代謝的影響,菌體快速生長階段則漆酶分泌量較低,只有當菌體達到一定濃度時,才會啟動漆酶合成[16]。菌體培養5 d后漆酶活力快速提升,在第8 d達到最高,為27.50 U/mL,此后漆酶活性逐漸降低,因此將硬毛粗蓋孔菌發酵產漆酶時間定為8 d。

圖2 培養時間對硬毛粗蓋孔菌菌絲體生長及漆酶活力的影響Fig.2 Effect of culture period on mycelial growth and laccase activity of F. trogii

2.2 漆酶發酵條件的選擇

2.2.1 碳源及濃度對發酵產漆酶的影響 單糖利于微生物的生長利用,但不利于漆酶的分泌,多糖難以被直接利用,影響菌體生長,但作為遲效碳源,有利于漆酶的分泌[17]。本研究中,玉米淀粉對硬毛粗蓋孔菌產漆酶的促進作用最強,漆酶活力達到最高,為32.53 U/mL,其次是甘油,由于甘油作為一種小分子,易于被細胞利用,因此同樣呈現出促進漆酶發酵的能力。硬毛粗蓋孔菌對多糖的利用能力較強,因此選擇以玉米淀粉作為最適碳源。分別比較不同濃度玉米淀粉對菌體發酵產漆酶的影響,結果如圖3B所示,由于碳源缺乏,低濃度玉米淀粉(如5 g/L)導致菌體生長不足進而影響漆酶的分泌。隨著碳源濃度的升高,漆酶活力逐漸增加,當玉米淀粉濃度為25 g/L,漆酶活力達到最大,隨后反而降低,因此選擇以25 g/L玉米淀粉作為最適碳源添加濃度。

圖3 碳源種類(A)及含量(B)對硬毛粗蓋孔菌發酵產漆酶的影響Fig.3 Effect of carbon sources and concentrations on the laccase production of F. trogii

2.2.2 氮源及濃度對發酵產漆酶的影響 不同氮源種類對菌體產漆酶的影響如圖4A所示,有機氮源對漆酶的發酵優于無機氮源,與陶君等[18]的研究結果一致。無機氮源中硝酸鉀和尿素對漆酶的分泌不利,推測可能由于菌株受不同氮源誘導產漆酶的效應不同,而酒石酸銨對硬毛粗蓋孔菌產漆酶促進作用較強,可見菌體對銨態氮的利用優于硝態氮。有機氮源中蛋白胨對漆酶的促進作用最強,漆酶活力達46.23 U/L,因此選擇以蛋白胨作為最佳氮源。分別加入不同濃度的蛋白胨,比較氮源濃度對菌體發酵產漆酶的影響,結果如圖4B,漆酶活力隨氮源濃度升高而增加,當蛋白胨濃度為2 g/L,漆酶活力達到最高,為51 U/mL,繼續增加濃度漆酶活力反而下降。因此,本研究中選擇以2 g/L蛋白胨作為最適氮源添加濃度。

圖4 氮源種類(A)及含量(B)對硬毛粗蓋孔菌發酵產漆酶的影響Fig.4 Effect of nitrogen sources and concentration on the laccase production of F. trogii

2.2.3 Cu2+及誘導劑對發酵產漆酶的影響 漆酶作為一種含銅多酚氧化酶,銅離子作為其酶活中心,能通過誘導基因表達、翻譯和翻譯后調控等方式調控漆酶的合成[19-21]。圖5表明低濃度Cu2+對漆酶有較強的誘導作用,漆酶活力隨著Cu2+濃度增加而增強,當Cu2+濃度為1.5 mmol/L,漆酶活力達到最高,為121 U/mL,是未誘導前的2.52倍,繼續增加Cu2+濃度,漆酶活性呈下降趨勢,高濃度Cu2+對菌體生長有抑制作用,不利于漆酶的生產。因此選擇以1.5 mmol/L作為Cu2+最適添加濃度。

圖5 Cu2+濃度對硬毛粗蓋孔菌發酵產漆酶的影響Fig.5 Effect of copper ion concentrations on the laccase production of F. trogii

漆酶作為一種誘導酶,加入誘導劑通?？梢蕴岣咂崦傅纳a活力,由于多數誘導劑對菌體生長不利,因此誘導劑通常在菌體生長一段時間后加入[22]。由圖6可知,不同種類的誘導劑對硬毛粗蓋孔菌產漆酶均有促進作用,其中香蘭素的促進作用最強,其漆酶活力較對照提高了92%。

圖6 不同誘導劑對硬毛粗蓋孔菌發酵產漆酶的影響Fig.6 Effects of inducers on the laccase production of F. trogii

2.2.4 培養條件對硬毛粗蓋孔菌發酵產漆酶的影響 在確定培養基組成的基礎上,進一步考察培養條件對硬毛粗蓋孔菌發酵產漆酶的影響,主要條件有溫度(圖7A)、初始pH(圖7B)和搖床轉速(圖7C)。結果表明,培養溫度在28～32 ℃之間,漆酶活力均較高,培養溫度高于30 ℃時,漆酶活力隨著溫度升高呈現下降趨勢,因此選擇以30 ℃作為最佳培養溫度。當培養基初始pH偏堿性條件下(pH為8～9),漆酶活力下降明顯,pH在4～7范圍內,酶活較高,pH為6時漆酶活力最高,研究報道初始pH為酸性對菌體發酵產漆酶有利,菌種發酵產漆酶多為偏酸性環境(pH4.5～6)[23],因此選擇pH6.0作為培養基初始pH。

圖7 不同培養條件對硬毛粗蓋孔菌發酵產漆酶的影響Fig.7 Effect of culture conditions on the laccase production of F. trogii注:A:溫度;B:初始pH;C:搖床轉速。

由圖7C可知,當靜置培養(搖床轉速為0),培養基中溶氧量較低,漆酶生產較低,硬毛粗蓋孔菌為嚴格好氧菌,氧氣對菌體生長及產酶至關重要[24]。隨著搖床轉速提升,培養基中溶氧量逐漸增多,漆酶活力隨之提高,當搖床轉速超過200 r/min時,漆酶活力下降,轉速過高會造成剪切力過大,不利于菌體的生長。因此選擇以200 r/min作為最適搖床轉速。

通過研究培養基組成及培養條件對硬毛粗蓋孔菌發酵產漆酶的影響,確定其最適發酵條件為:碳源為玉米淀粉(25 g/L),氮源為蛋白胨(2 g/L),Cu2+添加量為1.5 mmol/L,誘導劑為香蘭素(1 mmol/L),培養溫度30 ℃、初始pH為6.0,搖床轉速為200 r/min,在此條件下硬毛粗蓋孔菌發酵8 d,其胞外漆酶活力最高為329 U/mL,是初始培養條件下的11.96倍。由于漆酶的活性受到培養因素等多方面的影響,因此優化培養條件是漆酶工作的研究重點。楊詠潔等[25]通過研究碳源、氮源及pH等不同培養條件對火紅密孔菌分泌產漆酶能力的影響,經優化后,漆酶活力最高達到238 U/mL,徐春燕等[15]研究培養基、誘導劑、Cu2+對膠質射脈革菌發酵產酶的影響,發現甘草渣與Cu2+復合誘導作用下,膠質射脈革菌胞外漆酶活力最高達到325.1 U/mL。本研究中比較培養基組成及培養條件對硬毛粗蓋孔菌產漆酶的影響,其胞外漆酶活力較初始培養條件有顯著提升,基于此,進一步考察漆酶對食用合成色素日落黃的降解脫色情況。

2.3 漆酶對不同濃度日落黃脫色效果比較

提取發酵后的粗酶液,考察漆酶粗酶液對不同濃度日落黃脫色效果的影響,結果如圖8,在低濃度水平下(50～200 mg/L),漆酶對日落黃的降解顯著,10 h脫色率均達到90%以上,24 h后對50、100、200 mg/L日落黃的脫色率分別為95.35%、94.45%、91.34%。隨著日落黃濃度的增加,漆酶對其脫色率逐漸降低。當日落黃濃度達到800 mg/L時,反應體系在10 h即達到飽和,脫色率基本保持不變。由于高濃度色素條件下,漆酶活性中心達到飽和,同時色素本身對漆酶的催化作用有負面影響,最終造成其脫色率較低[26]。鄭苗苗等[27]研究了紅平菇漆酶對不同合成染料的降解,漆酶對40 mg/L偶氮類甲基橙24 h的降解率為45%,本研究中,硬毛粗蓋孔菌胞外漆酶對不僅偶氮類色素的脫色作用顯著,并且可以耐受較高的底物濃度(800 mg/L),表明該漆酶在偶氮類色素降解方面具有較大的應用前景。

圖8 漆酶粗酶液對不同濃度日落黃的降解Fig.8 The decolorization of crude laccase to different concentrations of sunset yellow

2.4 漆酶介體及抑制劑對日落黃脫色的影響

為進一步驗證漆酶對日落黃的脫色,分別考察了漆酶介體ABTS及漆酶抑制曲酸對日落黃脫色的影響。

2.4.1 ABTS對日落黃的脫色影響 高活性ABTS不僅是漆酶的特殊底物,也是使用廣泛的介質之一,ABTS與漆酶形成LMS(laccase mediator system),ABTS充當“電子梭”,可在漆酶與底物之間發揮電子傳遞的作用,不僅拓寬作用底物范圍,同時提高漆酶的催化效率[28]。本研究分別選擇100和600 mg/L日落黃作為底物濃度,對比漆酶與漆酶-介體系統(LMS)對日落黃的脫色情況,結果如圖9,漆酶-介體系統可顯著提升日落黃的降解效率,日落黃低濃度體系下(100 mg/L)3 h脫色率已達到87.54%,5 h脫色率已基本達到平衡,當日落黃濃度為600 mg/L時,漆酶-介體系統對日落黃的脫色作用增強,最終脫色率為92.45%,對比不添加介體系統的脫色率僅為84.45%。小分子介體(ABTS)的加入,不但可以提升漆酶對日落黃的脫色效率,而且還可以加快底物的脫色速率,降低高濃度底物對漆酶的抑制作用。

圖9 漆酶介體對日落黃脫色的影響Fig.9 The effect of laccase mediator on decolorizaiton of sunset yellow

2.4.2 抑制劑曲酸對漆酶降解日落黃的影響 曲酸是漆酶特異性的抑制劑,在反應體系中加入曲酸對漆酶活性產生抑制作用[29]。結果如圖10所示,隨著曲酸濃度的升高,漆酶活力逐漸被抑制,當曲酸濃度達到100 mmol/L時,與未添加曲酸對照相比,漆酶活力喪失了93.20%。由于曲酸的加入使得漆酶活性受到抑制,日落黃的脫色率也隨之降低,當曲酸濃度為100 mmol/L時,日落黃脫色率僅為7.14%,較未添加曲酸的對照組降低了92.57%。表明漆酶在對日落黃的降解脫色中發揮了重要作用。

圖10 不同濃度曲酸對漆酶酶活的抑制及日落黃脫色的影響Fig.10 The effect of different concentrations of kojic acid on laccase activity inhabition and decolorization of sunset yellow

3 結論

硬毛粗蓋孔菌最適發酵產漆酶條件為:碳源為玉米淀粉(25 g/L),氮源為蛋白胨(2 g/L),Cu2+添加量為1.5 mmol/L,誘導劑為香蘭素(1 mmol/L),培養溫度30 ℃、初始pH為6.0,搖床轉速為200 r/min,培養8 d后漆酶活力最高為329 U/mL,是初始培養條件下的11.96倍。漆酶粗酶液對日落黃顯示出較強的降解脫色作用,并可耐受較高的底物濃度,該漆酶對偶氮類色素具有較好的降解脫色效果。漆酶介體ABTS的加入可顯著提升漆酶對日落黃的脫色速率及脫色效率:當日落黃濃度為100 mg/L時,5 h脫色率基本已達到平衡,600 mg/L日落黃底物濃度下脫色率可達92.45%;而漆酶抑制劑曲酸的加入降低了漆酶活性,當曲酸濃度為100 mmol/L時,日落黃脫色率僅為7.14%,表明漆酶在偶氮類合成色素降解脫色中發揮了重要作用。硬毛粗蓋孔菌作為產漆酶優勢菌株,對今后漆酶在合成色素降解的應用具有重要的意義。