D-松醇復配Mn2+對HepG2細胞胰島素抵抗的調節及其作用機制

王 夢,張澤生,李雨蒙,劉亞萍,張文菱子

(天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457)

胰島素抵抗是指各種原因使胰島素促進葡萄糖攝取和利用的效率下降[1-2]。胰島素抵抗不僅是II型糖尿病的發病基礎,也是高血脂癥及代謝綜合癥的共同病理基礎[3-4]。因此緩解胰島素抵抗是預防及改善II型糖尿病的重要環節[5-6]。HepG2細胞是與人體肝細胞極為相似的肝胚胎瘤細胞株[7-8],在高水平的胰島素作用條件下,HepG2細胞表面胰島素受體的數目下降。因此采用HepG2細胞建立胰島素抵抗細胞模型,便于觀察干預因素對胰島素抵抗的直接影響[9-10]。

D-松醇是D-手性肌醇的一種甲基化衍生物,詹天榮等[11]和Kim等[12]研究結果表明,D-松醇具有類胰島素的作用,它能夠通過提高機體對胰島素的敏感程度來緩解機體胰島素抵抗現象,調控機體血糖水平,而且D-松醇在促進胰島素功能的同時還可以為機體傳輸營養物質。D-松醇還具有抗腫瘤[13]、免疫調節[14]和抗炎癥[15]等生物活性。有研究表明,D-松醇可與肝細胞受損后產生的半乳糖胺在Mn2+的螯合作用下,形成胰島素第二信使[16],改善胰島素抵抗癥狀。

胰島素能調控糖代謝關鍵酶的基因表達,且胰島素通過信號轉導途徑影響糖異生關鍵酶的活性,而胰島素信號轉導強度的增加或減少、發生障礙等均會影響胰島素的敏感性[17-21]。AMPK 是糖代謝的主要調控分子,是胰島素發揮生理效應的主要信號轉導通路,因此可作為II型糖尿病、肥胖癥和癌癥的潛在治療靶標[22-26]。

目前,關于D-松醇復配Mn2+緩解胰島素抵抗和作用機制的研究未見報道。本實驗通過胰島素誘導HepG2細胞建立胰島素模型,探究D-松醇復配Mn2+后的降血糖作用效果,并初步探討其作用機制,為預防或延緩糖尿病及其并發癥的發生發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-松醇 純度95%,購于西安一品生物技術有限公司;食品級MnSO4科漢森(天津)食品添加劑公司;人肝癌細胞(HepG2) 中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心;胰島素 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;高糖DMEM培養基 美國Hyclone公司;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;青霉素-鏈霉素混合溶液、Trizol、cDNA合成試劑盒 北京索萊寶生物科技有限公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT) 美國Sigma公司;胰蛋白酶 美國Gibco公司;完全培養基組成成分:10%滅火胎牛血清、1%雙抗、0.02%兩性霉素葡萄糖,肝肌糖原測定試劑盒 南京建成生物工程研究院;PCR引物 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。

Multiskan FC酶標儀、GSORVALL LEGEND MICRO 17R臺式冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司;MCO-15AC CO2培養箱 日本三洋電器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HepG2細胞的培養 凍存的HepG2細胞置于37 ℃恒溫水中,迅速震蕩凍存管,使細胞凍存液盡快融化,后吸取細胞懸液置于離心管中。經過復蘇后轉入細胞培養瓶中,加入完全培養基,于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育培養,每隔24 h換液一次,待細胞貼壁80%以上時吸棄培養液,用pH7.2～7.4的PBS緩沖溶液清洗2遍,加入1 mL 0.25%的胰蛋白酶消化液均勻鋪滿瓶底消化30～60 s,吸棄消化液,加入4 mL細胞培養液輕輕吹打得到細胞懸液,按照1∶4的比例轉至新的細胞培養瓶中培養,以完成細胞的傳代[10]。每48 h進行一次傳代操作,選擇處于生長對數期的細胞進行實驗。

1.2.2 HepG2細胞胰島素抵抗模型的建立

1.2.2.1 不同濃度胰島素對HepG2細胞增殖的影響 將處于對數期(24 h)的細胞濃度調至1×105個/mL轉移至96孔培養板中,每孔100 μL。待細胞單層貼壁后棄去培養液,加入不同濃度的胰島素溶液,胰島素濃度分別為1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6mmol/L,并設立正常對照組,每組10個復孔,培養36 h。向每孔加入20 μL濃度為5 g/L的MTT溶液,培養箱內培養4 h后棄去混合溶液,加入150 μL二甲基亞砜溶液充分震蕩10 min,酶標儀490 nm波長下掃描并記錄結果。

1.2.2.2 胰島素最佳作用濃度的確定 將處于對數生長期(24 h)的細胞濃度調至1×105個/mL，之后轉移至96孔培養板中培養,每孔100 μL。待細胞單層貼壁后棄去培養液,加入不同濃度的胰島素溶液(胰島素濃度分別為1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6mmol/L,并設立正常對照組,每組10個復孔)。培養箱內培養36 h后棄去培養基,PBS清洗后加入無酚紅DMEM培養液(不含血清)孵育24 h,取出96孔板。用葡萄糖測定試劑盒測定各孔培養基中葡萄糖含量,以無細胞的空白孔作為對照,計算各組細胞的葡萄糖消耗量。選擇葡萄糖消耗量差值最大的胰島素作用濃度為胰島素最佳濃度。葡萄糖消耗量計算公式如公式1。

式(1)

式中:5.55為計算常數。

1.2.2.3 胰島素最佳作用時間的確定 確定胰島素最佳濃度后,重復上述方法,設立正常對照組和模型對照組,每組10個復孔,正常對照組加入正常DMEM 培養液,模型對照組加入含有最佳胰島素濃度的DMEM培養液,分別培養24、36、48 h,測定各組的葡萄糖消耗量,選取模型對照組和正常對照組葡萄糖消耗量出現極顯著性差異的時間為胰島素的最佳作用時間。

1.2.2.4 HepG2細胞胰島素抵抗模型穩定時間的確定 選用上述實驗中胰島素最佳作用濃度和時間來建立HepG2 細胞胰島素抵抗模型。重復上述方法,正常對照組和模型對照組處理后換為無酚紅DMEM 培養液，繼續培養12、24、36 h,用葡萄糖測定試劑盒測定各組的培養液上清液中的葡萄糖含量,并計算各組的葡萄糖消耗量,來判定該胰島素抵抗模型的穩定時間。

1.2.3 樣品毒性實驗(MTT實驗) 選擇處于對數生長期的細胞進行D-松醇和MnSO4毒性實驗。首先將細胞濃度調至1×105個/mL并轉移至96孔培養板中培養,每孔100μL。待細胞貼壁后吸去培養基,PBS 清洗兩次。加入不同質量濃度D-松醇0、10、50、100、200、400、600、800 mg/L)和MnSO4(0、1、5、10、50、100 mg/L),每組設立10個復孔,每孔100 μL,培養24 h。向每孔加入20 μL 濃度為5 g/L的MTT溶液,繼續培養4 h后棄去混合溶液,加入150 μL二甲基亞砜溶液充分震蕩10 min,酶標儀490 nm波長下掃描并記錄結果。評價不同受試樣品的不同濃度對HepG2細胞增殖的影響。

1.2.4 樣品對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響 選擇處于對數生長期的細胞將濃度調至1×105個/mL并轉移至96孔培養板中培養,每孔100 μL。按照1.2.2方法建立胰島素抵抗細胞模型。實驗樣品設立正常對照組、模型對照組和D-松醇復配MnSO4不同劑量組(D-松醇濃度為50、100、200 mg/L;MnSO4濃度為1、5、10 mg/L;每組設10個復孔)。在樣品處理24 h后采用葡萄糖氧化酶法檢測培養液中葡萄糖含量,以不鋪細胞的空白孔為空白對照,計算24 h后各組細胞的葡萄糖消耗量。

1.2.5 糖原含量的測定 選擇處于對數生長期的細胞將濃度調至1×105個/mL并轉移至6孔培養板中培養,每孔2 mL。按照1.2.2方法建立胰島素抵抗細胞模型。實驗樣品設立正常對照組、模型對照組和D-松醇復配MnSO4不同劑量組(D-松醇濃度為50、100、200 mg/L;MnSO4濃度為1、5、10 mg/L;每組設2個復孔)。在樣品處理24 h后采用硫酸蒽酮法檢測細胞中糖原含量,以不鋪細胞的空白孔為空白對照,計算24 h后各組細胞的糖原含量。公式如式2。

糖原含量(mg)=×M×A×10/1.11

式(2)

式中:10:測試過程中的稀釋倍數;1.11:此法獲得的葡萄糖含量換算成糖原含量的系數;M:標準管含量(mg);A:樣品測試前稀釋倍數。

1.2.6 實時熒光全定量分析(RT-PCR)實驗 用PBS將細胞收集后采用Trizol法提取細胞RNA,反轉錄得到cDNA,再利用Real-time PCR法以GADPH為看家基因,檢測各劑量組IRS-1、IRS-2、AMPKα-1、AMPKα-2、PGC-1α、PEPCK、G6Pase、GLUT4基因mRNA表達水平。PCR引物設計如表1所示,實驗分組如表2所示。

表1 全定量PCR引物設計序列Table 1 Real-time PCR primer design sequences

表2 實驗設計方案Table 2 Experimental design for grouping rats

1.3 數據處理

本實驗所得數據均采用數理統計軟件進行統計學分析,實驗數據以“均值±標準偏差”(M±SD)表示,采用Duncans進行多重比較檢驗。組間分析采用t檢驗,p<0.05表示兩組之間具有顯著性差異,p<0.01表示兩組之間具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 HepG2細胞胰島素抵抗模型建立

胰島素誘導HepG2細胞建立胰島素抵抗模型,結果如圖1所示。由圖1A可知,各實驗濃度胰島素對HepG2細胞的正常增殖無影響。故選用此系列實驗濃度進行葡萄糖消耗量試驗,由圖1B可知,與正常對照組相比,當胰島素濃度為1×10-3mmol/L時,細胞培養液中的葡萄糖消耗量極顯著性降低(p<0.01),說明細胞產生顯著的胰島素抵抗現象,故建造HepG2細胞胰島素抵抗模型時選用胰島素的作用濃度為1×10-3mmol/L。

由圖1C可知,與正常對照組相比,當胰島素作用時間為24 h時,胰島素樣品組葡萄糖消耗量顯著性降低(p<0.05),且在36 h時極顯著性降低(p<0.01),說明細胞產生明顯的胰島素抵抗現象,故選取36 h為建造HepG2細胞胰島素抵抗模型的最佳作用時間。

本實驗在建立胰島素抵抗模型基礎上,對該模型的作用穩定時間進行了研究,采用1×10-3mmol/L濃度的胰島素處理細胞36 h后,換成無酚紅DMEM高糖培養基,分別于12、24、36 h后檢測上清液中葡萄糖消耗量。結果如圖1D所示,與正常對照組相比,12 h后上清液中葡萄糖消耗量出現顯著性降低(p<0.05),24 h和36 h出現極顯著性降低(p<0.01),說明該胰島素抵抗模型在建模成功后36 h內穩定。

圖1 HepG2細胞胰島素抵抗模型實驗結果Fig.1 Results of insulin resistance in HepG2 cells注:NC：正常對照組；*:p<0.05,與正常對照組比較具有顯著性差異; **:p<0.01,與正常對照組比較具有極顯著性差異;圖2同。

2.2 受試樣品對HepG2細胞增殖的影響

D-松醇和MnSO4對HepG2細胞增殖的影響如圖2所示。由圖2A可知,D-松醇濃度在0～400 mg/L范圍內,各組在490 nm波長下的吸光度值無差異;濃度在600～800 mg/L范圍內,各組的吸光度值略有升高,但無顯著性差異。說明D-松醇在該濃度范圍內對HepG2細胞的正常增殖無顯著性影響,故后續實驗所選用的D-松醇濃度在0～400 mg/L范圍內。由圖2B可知,MnSO4濃度在0～10 mg/L范圍內,各組在490 nm波長下的吸光度值無顯著性差異;濃度在50～100 mg/L范圍內,各組的吸光度值極顯著性降低(p<0.01)。說明MnSO4在0～10 mg/L濃度范圍內對HepG2細胞的正常增值無顯著性影響,在50～100 mg/L濃度范圍時,抑制細胞正常增殖,故后續實驗所選用的MnSO4濃度在0～10 mg/L范圍內。

圖2 D-松醇和MnSO4對HepG2細胞增殖的影響Fig.2 Effect of D-pinitol and MnSO4 on proliferation of HepG2 cells

2.3 受試樣品對HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響

D-松醇和復配MnSO4對HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響如圖3所示。由圖3A可知,和正常對照組相比,模型對照組的葡萄糖消耗量極顯著降低(p<0.01),說明造模成功,細胞產生胰島素抵抗。和模型對照組相比,當D-松醇濃度為100～200 mg/L時,葡萄糖消耗量有升高趨勢,但無顯著性差異,而D-松醇濃度為400 mg/L時,葡萄糖消耗量極顯著升高(p<0.01)。由圖3B可知,和正常對照組相比,模型對照組的葡萄糖消耗量極顯著降低(p<0.01),說明造模成功,細胞產生胰島素抵抗。和模型對照組相比,當D-松醇濃度為100 mg/L時,復配MnSO4濃度為5 mg/L時,葡萄糖消耗量顯著性升高(p<0.05),MnSO4濃度為10 mg/L時,葡萄糖消耗量極顯著性升高(p<0.01)。

圖3 D-松醇和復配MnSO4對HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響Fig.3 Effects of D-pinitol and compound with MnSO4 on glucose consumption of HepG2 cells注:#:p<0.01,劑量組與模型對照組比較具有顯著性差異; ##:p<0.01,劑量組與模型對照組比較具有極顯著性差異; NC：正常對照組；DC：模型對照組；圖4～圖5同。

2.4 受試樣品對HepG2細胞糖原含量的影響

D-松醇和復配MnSO4對HepG2細胞糖原含量的影響如圖4所示。由圖4A可知,與正常對照組相比,模型對照組糖原含量極顯著性降低(p<0.01),說明細胞合成糖原能力下降,細胞造模成功。與模型對照組相比,當D-松醇濃度為50～200 mg/L時,糖原含量有升高趨勢,但無顯著性差異,而D-松醇濃度為400 mg/L時,糖原含量極顯著升高(p<0.01)。由圖4B可知,與正常對照組相比,模型對照組糖原含量極顯著性降低(p<0.01),說明細胞合成糖原能力下降,細胞造模成功。和模型對照組相比,當D-松醇濃度為100 mg/L時,復配MnSO4濃度為5 mg/L時,糖原含量顯著性升高(p<0.05),MnSO4濃度為10 mg/L時,糖原極顯著性升高(p<0.01)。

圖4 D-松醇和復配MnSO4對HepG2細胞糖原含量的影響Fig.4 Effects of D-pinitol and compound with MnSO4 on glycogen content of HepG2 cells

2.5 受試樣品對HepG2細胞相關基因表達的影響

如圖5,與模型組相比,DP組各基因mRNA表達水平均未出現顯著性變化；LPM組AMPKα-1、AMPKα-2和GLUT4基因mRNA表達水平顯著上調(p<0.05)，G6Pase基因mRNA表達水平顯著下調(p<0.05)；MPM組ISI-1、ISI-2、AMPKα-2和GLUT4基因mRNA表達水平顯著上調(p<0.05)，AMPKα-1基因mRNA表達水平極顯著上調(p<0.01)，同時，PEPCK基因mRNA表達水平顯著下調(p<0.05)，G6Pase基因mRNA表達水平極顯著下調(p<0.01)；HPM組ISI-1、ISI-2、AMPKα-1、AMPKα-2和GLUT4基因mRNA表達水平極顯著上調(p<0.01)，PGC-1α和PEPCK基因mRNA表達水平顯著性下調(p<0.05)，G6Pase基因mRNA表達水平極顯著下調(p<0.01)。D-松醇復配Mn2+可激活IRS-1和IRS-2基因,促進下游基因的表達;激活AMPKα-1和AMPKα-2基因的磷酸化,促進糖酵解的發生;激活PGC-1α基因的磷酸化,降低激活糖異生關鍵酶造成肝糖輸出的增加,進而改善胰島素抵抗;激活PEPCK基因的磷酸化,進而促進糖異生;激活G6Pase基因的磷酸化,進而促進下游基因的表達,促進糖原分解;激活GLUT4基因的磷酸化,進而促進下游基因的表達,促進葡萄糖轉運。

圖5 受試樣品對HepG2細胞相關基因mRNA表達水平的影響Fig.5 Effects of fermented beverage on the concentration of AMPK in gene level in HepG2 cells

3 結論

本實驗采用胰島素誘導HepG2細胞,對胰島素作用濃度、作用時間和模型穩定時間進行研究,建立體外胰島素抵抗模型。在胰島素濃度為1×10-3mmol/L,作用時間為36 h時,細胞葡萄糖消耗量達到最低,產生最大的胰島素抵抗效應。此時,進行D-松醇和復配MnSO4對HepG2細胞胰島素抵抗影響的研究,結果表明,當D-松醇濃度為100 mg/L,復配MnSO4為10 mg/L時,可極顯著的緩解胰島素抵抗。此外,復配組AMPKα-1、AMPKα-2和GLUT4基因表達水平均顯著上調(p<0.05),G6Pase基因mRNA表達水平顯著下調(p<0.05)。AMPK對糖代謝具有廣泛的影響,在促進葡萄糖轉運,加強糖酵解以及抑制糖異生等生化反應中均發揮一定功能。

本實驗結果為D-松醇復配Mn2+緩解HepG2細胞胰島素抵抗提供科學依據,但本研究只局限于生理表層和基因表達方面,將來更需要通過蛋白質組學和代謝組學等實驗對降血糖機制進一步評價分析,為D-松醇在食品工業中的研究開發提供進一步的理論幫助。