小鼠核糖核酸酶抑制劑異源高效可溶性表達、純化及活性研究

付大偉,孫瑩瑩,徐 偉

(哈爾濱商業大學食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

核糖核酸酶抑制劑(Ribonuclease Inhibitor,RI)是一種能夠調節核糖核酸酶活性的酸性胞漿蛋白[1],廣泛應用于涉及RNA的分子生物學實驗中。它與核糖核酸酶(RNase)以1∶1的比例結合抑制RNase活性[1]。它是一個在任何應用中對付潛在RNase污染的十分有效的試劑。

目前,雖然市面上有較多商品化的RI出現,但是價格較為昂貴。以大腸桿菌為宿主的重組蛋白原核表達方法由于成本降低而被廣泛使用[1]。但是,重組RI的表達很難在大腸桿菌的細胞質中以可溶性的形式大量存在[2]。因此提高目的蛋白可溶性表達極為重要。

本研究旨在獲得MRNI在大腸桿菌中的高效可溶性表達。通過構建含SUMO、IF2、GST等不同融合標簽的八種重組表達載體,以大腸桿菌BL21(DE3)作為宿主菌自誘導表達及利用MagNi磁珠純化,采用低溫誘導提高重組蛋白表達量。進一步研究該酶是否具有抑制RNase A,防止RNA被降解的作用,為核糖核酸酶抑制劑的生產及應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

E.coliBL21(DE3)菌株、E.coliTrans I菌株 本實驗室提供;HiFi DNA聚合酶、DNA Marker(15000 bp)、蛋白質Marker(120 kDa)、核糖核酸酶抑制劑 北京全式金生物技術有限公司;T4 DNA連接酶、限制性內切酶BamHI、NotI NEB公司;二硫蘇糖醇(DTT)、氨芐青霉素(Ampr)、三羥甲基氨基甲烷(Tris) Taraka公司;NP40 Sigma公司;溶菌酶 Amresco公司;核糖核酸酶A 北京沁源惠幟生物技術有限公司;MagNi Protein Purification Kit 北京諾貝奧生物技術有限公司;裂解緩沖液、ZYP+5052自誘導培養基[3](碳源為葡萄糖和α-乳糖) Thermo公司；實驗所用質粒均由本實驗室之前構建,特性[4]如表1所示。

T100 TM Thermal Cycler PCR儀 美國BIO-RAD公司;H2050R臺式離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;Gds8000凝膠成像儀 美國Uvp公司;DK-8D電熱恒溫水槽、DHP-9162恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;DZP-102恒溫振蕩器 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MRNI基因的擴增引物的設計 通過MRNI基因在Genbank數據庫中報道的序列及所用載體的序列決定。分別于上、下游引物的5′端插入了BamHI和NotI酶切位點。上游引物P1:5′-TCCAGGG GCCCCTGGGATCCATGAGTCTTGACATCCAGTGTGAG

-3′,下游引物P2:5′-GGTGGTGCTCGAGTGCGG CCGCTCAGGAAATGATCCTCAGGGAAG-3′,引物被送到上海生工生物有限公司進行合成。以全基因合成的MRNI基因為模板,利用P1、P2引物進行PCR擴增。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的產物,并通過膠回收重新獲取基因片段,經BamHI和NotI 酶切后進行柱回收。

1.2.2 重組表達載體的構建 通過T4DNA連接酶將其與經BamHI和NotI酶切后的pNBE3C Ⅰ～Ⅷ表達載體相連,得到重組載體pNBE3C Ⅰ～Ⅷ-MRNI,并將其轉化至E.coliTrans I克隆感受態細胞中,于Ampr抗性平板涂布培養。經過菌落 PCR 和酶切鑒定篩選陽性單克隆菌落,同時送至上海生工生物有限公司進行序列測定。

1.2.3 重組菌的自誘導表達 將測序成功的八種重組載體熱激轉化到表達感受態細胞E.coliBL21(DE3)中,于Ampr抗性平板涂布培養,挑取單菌落,于Ampr抗性的 1 mL LB液體培養基中接種,37 ℃搖床培養16 h,再以1‰接種量于10 mL自誘導培養基[5-8]中接種,37 ℃150 r/min自誘導6 h,20 ℃ 150 r/min培養24 h,離心收集菌體[9],12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察蛋白條帶。

1.2.4 重組蛋白的可溶性表達檢測 取1 mL 1.2.3中獲得的菌液,12000 r/min 5 min離心,收集菌體,加入含50 mmol/L Tris-HCl pH8.0的裂解緩沖液及濃度1 mg/mL的溶菌酶,懸浮菌體,過夜凍存,取出于37 ℃融化30 min,加入1%的500 mmol CaCl2、1%的1 mg/mL DNase,混勻后放于37 ℃水浴30 min,取出后加入1/10的5 mol NaCl,12000 r/min,離心5 min。向上清中加入少量磁珠,目的蛋白與其結合5 min后于磁力架上吸附,收集穿透峰;加入含10 mmol咪唑的Tris-HC1緩沖液漂洗雜蛋白,重復5次;加入含500 mmol咪唑的Tris-HC1緩沖液,結合5 min后洗脫目的蛋白[10]。將離心得到的沉淀、上清,純化的穿透峰及洗脫液[3]在12%聚丙烯酰胺凝膠點樣分析,選出高效表達的菌株。

1.2.5 融合蛋白MRNI的自誘導表達條件的優化

1.2.5.1 自誘導溫度對可溶性蛋白表達量的影響 向4瓶10 mL滅菌后的ZYP+5052自誘導培養基中加入Ampr,以1‰接種量將菌液分別接種,37 ℃搖床培養測得600 nm分光光度值0.2左右時,將其分別放至16、20、25、30 ℃搖床培養[11]至分光光度值達1.5左右時,離心收集菌體,按照1.2.4中方法純化檢測可溶性MRNI及12%聚丙烯酰胺凝膠分析。

1.2.5.2 自誘導時間對可溶性蛋白表達量的影響 向20 mL滅菌后的ZYP+5052自誘導培養基中加入Ampr,以1‰接種量將菌液分別接種,37 ℃搖床培養至600 nm分光光度值為0.2左右時,放置20 ℃分別搖床培養12、14、16、17、18、20、21、22、23、24、26 h時,收集菌體磁珠純化后取洗脫液進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

1.2.6 裂解菌體及MagNi磁珠純化 向100 mL滅菌后的ZYP+5052自誘導培養基中加入Ampr,以1‰接種量將菌液分別接種,37 ℃搖床培養6 h,20 ℃培養24 h,離心得到沉淀。加入含50 mmol/L Tris-HC1 pH8.0的裂解緩沖液及1 mg/mL的溶菌酶,懸浮菌體。放于-20 ℃過夜凍存,取出于37 ℃融化30 min,加入1%的500 mmol/L CaCl2,1%的1 mg/mL DNase[12],混勻后放于37 ℃水浴30 min,取出后加入1/10的5 mol/L NaCl[13],12000 r/min離心5 min。收集上清按照1.2.4中的磁珠純化說明書操作步驟進行純化。

1.2.7 純化后的IF2-MRNI的濃度測定 將純化后的蛋白通過PEG 2000濃縮,再經透析除鹽,用BCA蛋白濃度測定法對IF2-MRNI濃度進行測定,取20 μL待測樣品及標準蛋白樣品,加入200 μL BCA染色液,于37 ℃靜置30 min后,用酶標儀測得562 nm處吸光值,以測得的蛋白標準品BSA作標準曲線。獲得的蛋白加入儲存液,凍存至-20 ℃。

1.2.8 融合蛋白IF2-MRNI的活性檢測 通過使用基于瓊脂糖凝膠的測定來測量在RI存在下的核糖核酸活性。以購買的RI作對照,將不同體積的融合蛋白IF2-MRNI加入到含有50 mmol/LTris-HCl緩沖液(pH7.4)、50 mmol/L NaCl、10 mmol/L DTT的反應混合物中[2],加入5 ng RNase A,在室溫孵育10 min,加入1 μg提取的植物總RNA。將混合物20 μL在室溫下孵育10 min。用1%瓊脂糖凝膠進行RNA電泳,并通過溴化乙錠染色核實。如果RNA條帶完好,未降解,說明其具有抑制RNA酶降解RNA 的作用,證明其具有一定活性。

1.3 數據處理

本研究中涉及的實驗內容均重復3次;蛋白濃度標準曲線繪制均采用 Microsoft Office Excel(2007)軟件;蛋白濃度測定采用SoftMax Pro 6.3.1軟件,應用 Adobe Photoshop CC 2014軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 目的基因的擴增

以全基因合成的MRNI基因為模板通過PCR擴增,在1%瓊脂糖凝膠電泳上可以看到一條清晰條帶大小約1383 bp(圖1),同預期目的片段大小相符。

圖1 PCR擴增MRNI基因Fig.1 PCR amplification of MRNI gene注:M:DNA Marker;1:MRNI基因PCR產物。

2.2 重組質粒的鑒定

分別將pNBE Ⅰ～Ⅷ表達載體(圖2)及擴增出的MRNI基因經BamHI和NotI酶切后,經T4DNA連接酶連接,轉化到E.coliTrans I中,于Ampr抗性平板涂布培養,37 ℃過夜培養,每種載體選取4個陽性菌落做菌落PCR檢測(圖3),確定重組表達載體構建成功。

圖2 酶連重組表達載體Fig.2 Enzyme-linked recombinant expression vector注:M:DNA marker;1:PCR 擴增的MRNI基因; 2～9:重組載體pNBE Ⅰ～Ⅷ。

圖3 菌落PCR鑒定重組表達載體Fig.3 Detection of the recombinant expression vector by PCR注:M:DNA marker;泳道1～4:重組質粒pNBE I-MRNI;泳道5～8:重組質粒pNBE II-MRNI;泳道9～12:重組質粒pNBE IIII-MRNI;泳道13～16:重組質粒pNBE IV-MRNI;泳道17～20:重組質粒pNBE V-MRNI;泳道21～24:重組質粒pNBE VI-MRNI;泳道25～28:重組質粒pNBE VII-MRNI;泳道29～32:重組質粒pNBE VIII-MRNI。

2.3 重組菌的自誘導表達

挑選檢測成功的菌株,按照質粒提取試劑盒方法提取質粒,將其轉化至表達感受態細胞E.coliBL21(DE3)中,篩選菌株接種后自誘導培養,收集沉淀,12%聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示(圖4),pNBE I和pNBEVI載體并未表達目的蛋白,重組菌BL21(DE3)/pNBE II-MRNI、BL21(DE3)/pNBE III-MRNI、BL21(DE3)/pNBE IV-MRNI、BL21(DE3)/pNBE V-MRNI、BL21(DE3)/pNBE VII-MRNI、BL21(DE3)/pNBE VIII-MRNI表達的融合蛋白與期望基本一致,大小分別為69.6、90.0、105.0、66.1、67.3、90.0 kDa。

圖4 MRNI誘導表達的12%聚丙烯酰胺凝膠分析Fig.4 Analysis of MRNI induced expression of 12% polyacrylamide gel注:M:蛋白質 Marker;1～8:分別為載體 pNBE Ⅰ～Ⅷ的自誘導表達的重組菌。

2.4 重組蛋白的可溶性表達鑒定

對1.3.3中得到的沉淀通過MagNi磁珠純化,對各重組菌表達可溶性MRNI的狀況進行檢測,通過12%聚丙烯酰胺凝膠電泳可以看出(圖5),重組菌BL21(DE3)/pNBE II-MRNI、BL21(DE3)/pNBE III-MRNI、BL21(DE3)/pNBE V-MRNI、BL21(DE3)/pNBE VII-MRNI 經過洗脫后蛋白條帶與期望值大小相符,分別是69.6、90、66.2、67.3 kDa。而從條帶上看雜蛋白含量最少的是重組菌BL21(DE3)/pNBE II-MRNI,重組蛋白IF2-MRNI表達量偏高,大小約69 kDa,同期望的分子質量大小基本一致。接下來優化此重組菌的培養條件,使其表達量提高。

圖5 MRNI可溶性表達的12%聚丙烯酰胺凝膠分析Fig.5 Analysis of soluble expression of MRNI by 12% polyacrylamide gel注:M:蛋白Marker;1～4:表達載體pNBE I的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;5～8:表達載體pNBE II的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;9～12:pNBE II的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;13～16:pNBE III的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;17～20:pNBE IV的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;21～24:pNBE V的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;25～28:pNBE VI的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;26～29:pNBE VII的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;30～32:pNBE VIII的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫。

2.5 重組蛋白IF2-MRNI自誘導表達條件優化

2.5.1 自誘導溫度對可溶性蛋白表達量的影響 誘導溫度不僅影響菌體的生長,同時也影響著重組蛋白的誘導表達[11]及包涵體的形成[14]。低溫誘導可以促進蛋白的可溶性表達[15]。通過12%聚丙烯酰胺凝膠可以看出,如圖中標注所示,20 ℃時形成的包涵體較少,洗脫液中蛋白含量最高,所以在20 ℃時表達量相對較高,條帶單一。確定最佳誘導溫度是20 ℃(圖6)。

圖6 誘導溫度對可溶性MRNI濃度的影響Fig.6 Effects of induced temperature on soluble MRNI concentration注:M:預染蛋白質 Marker;1～4:16 ℃時誘導的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;5～8:20 ℃時誘導的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;9～12:25 ℃時誘導的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;13～16:30 ℃時誘導的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫。

2.5.2 自誘導時間對可溶性蛋白表達量的影響 通過12%聚丙烯酰胺凝膠可以看出,誘導后菌體表達量因時間增加而變多[11],如圖7,在誘導 24 h 時,MRNI 表達量最高,同時菌體內的蛋白酶對重組蛋白的降解也會增加,所以過長時間的誘導對重組蛋白的表達反而有害[11],MRNI 的表達量也會降低,確定最佳誘導時間是24 h。

圖7 不同表達時間對MRNI表達的影響Fig.7 Effect of different expression time on MRNI expression注:M:蛋白質 Marker;1～11:誘導表達時間分別為 12、14、16、17、18、20、21、22、23、24、26 h的菌體。

2.5.3 MagNi磁珠純化 如圖8所示,穿透中有極少量IF2-MRNI,但漂洗中幾乎看不到蛋白條帶,證明蛋白與磁珠結合情況較好,收集洗脫蛋白只有一條大小為是69.6 kDa的清晰帶,同期望一致,純化量高。

圖8 磁珠純化MRNI的12%聚丙烯酰胺凝膠分析Fig.8 12% polyacrylamide gel analysis of MRNI purified by magnetic beads注:M:蛋白質Marker;1:菌體裂解后的沉淀;2:菌體裂解后的上清;3:純化穿透峰;4～7:純化雜蛋白漂洗;8～13:第1次到第6次分批次洗脫得到的MRNI。

2.5.4 重組蛋白 IF2-MRNI 的濃度測定 用酶標儀測得562 nm處吸光值為2.9248,根據蛋白濃度標準曲線(圖9),可計算出所測蛋白濃度為3621.3 mg/L。

圖9 BCA蛋白濃度測定標準曲線Fig.9 BCA protein concentration determination standard curve

2.5.5 融合蛋白IF2-MRNI的活性檢測 如圖10,泳道2、3、6、7、8的RNA均降解;由泳道4、5看出,加入購買的RI超過0.8 μL時,RNA不會降解,由泳道9、10看出,純化后的IF2-MRNI加入超過1 μL時,RNA不會降解。與購買的RI對比,可得酶活力大約為40 U/μL。

圖10 MRNI酶活性檢測Fig.10 Detection of MRNI enzyme activity注:M:DNA marker;泳道1:提取的植物葉片RNA;泳道2～5:加入體積為0.4、0.6、0.8、1.0 μL購買的RI;泳道6～10:加入體積分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μL IF2-MRNI。

3 結論

本實驗構建了含SUMO、IF2、GST、NusA、MsyB、Trx和MBP融合標簽的重組表達載體,通過磁珠純化法檢測可溶性表達情況,最終篩選出表達量高的重組菌BL21(DE3)(pNBEII-MRNI),通過優化溫度和時間確定最佳自誘導條件:37 ℃培養6 h,20 ℃培養24 h。通過磁珠純化法檢測并得到表達量高的融合蛋白IF2-MRNI,濃縮脫鹽后利用BCA法測定其濃度為3621.3 mg/L。利用IF2-MRNI抑制RNA酶水解RNA的能力測定其活性,得到的融合蛋白酶活約為40 U/μL。為了實現IF2-MRNI的可溶性表達,利用融合標簽構建表達載體,選取BL21(DE3)作為宿主菌及采用低溫誘導。但因蛋白質性質不同,促進可溶性表達的方法自然不同,所以使MRNI達到最高表達量的方法還需深入探索。通過上述實驗可知,低溫條件更有利于蛋白的正確折疊及可溶性表達。