等電點法純化太平洋鱈魚皮膠原蛋白及其結構特性研究

劉鳳鳴,李八方,侯 虎

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

我國是漁業大國,2014年魚類總產量即已接近4000萬噸[1]。水產品加工業的快速發展,隨之而來的是加工中產生的大量副產品,如魚皮、魚骨、魚鱗等。大量副產品未經處理便被隨意丟棄,不僅造成了環境污染,還造成了生物資源的浪費。而這些副產品中,以鱈魚皮為例,淑英等[2]發現,鱈魚皮干物質中有50%以上為膠原蛋白。且鱈魚屬于深海魚類,污染小,是生產膠原蛋白的優質原料。

在膠原蛋白的生產過程中,純化是極其重要的一步,純度高的膠原蛋白才能應用于醫藥領域。傳統的膠原蛋白純化方法主要是鹽析法,常用的鹽類是氯化鈉、硫酸銨等。鹽析法的原理在于,加入鹽溶液后,鹽分子所帶的電荷會中和膠原蛋白分子表面的電荷,使膠原蛋白分子之間的靜電相互作用降低,逐漸聚集并沉淀下來[3]。鹽析法具有回收率高、無污染的優點,且不會對膠原蛋白的三螺旋結構產生影響,因此一直被用于膠原蛋白的純化領域。但是鹽的加入會使后期的透析時間大大延長，一般鹽析后需要透析3～4 d,才能保證終產品不受鹽和酸的影響。任海濤等[4]采用鹽析法純化鼠尾膠原蛋白,需在超純水中持續透析3 d,每天換液3次。

等電點沉淀法是利用蛋白質在其等電點時溶解度最低,且不同蛋白質具有不同的等電點進行分離的方法。等電點沉淀法具有效率高、專一性強等特點,且不需要后期長時間的透析,因此應用廣泛。例如被用于牛奶乳清蛋白[5]的分離純化,藻類蛋白的提取[6],甚至是污水蛋白的回收[7],但關于其在膠原蛋白回收純化中的應用鮮有報道。

因此,本文采用等電點沉淀法純化鱈魚皮膠原蛋白,以期為一種新的、高效的膠原蛋白純化方法提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱈魚皮 青島三洋水產品加工公司;氫氧化鈉、氯化鈉、冰醋酸、溴化鉀 分析純,國藥集團;鼠尾Ⅰ型膠原蛋白 美國Sigma公司;蛋白質Marker 美國New England生物技術有限公司;BCA法總蛋白測試試劑盒 南京建成生物工程研究所。

ZS90型Zeta電位分析儀 英國Malvern Instruments公司;Powerpac型電泳儀 美國Bio-Rad公司;Powerwave XS型酶標儀 美國Biotek公司;UV-2102PC型紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;200SXV型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司;D8 Advance型X-射線衍射儀 德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠原粗溶液和膠原蛋白凍干品的制備 取新鮮潔凈鱈魚皮,用干凈剪刀剪成1 cm×1 cm的塊狀,按照1∶60 g/mL加入冷藏0.08 mol/L的氫氧化鈉溶液,于4 ℃環境下采用磁力攪拌器攪拌12 h。后以冷藏蒸餾水清洗至中性。在按料液比1∶60 g/mL,乙酸濃度為0.55 mol/L的條件,于4 ℃攪拌酸提至大部分魚皮溶解,4 ℃環境下9000 r/min(8603×g)離心30 min后取上清液即為膠原蛋白粗提液。取一部分膠原粗溶液,加入預先磨好的氯化鈉粉末至終濃度為1.5 mol/L。后采用0.5 mol/L乙酸溶液攪拌復溶12 h,采用500 Da透析袋,隔6 h換一次透析液(蒸餾水),連續透析3 d后,凍干得到經鹽析法純化得到的膠原蛋白干品。

1.2.2 溶解度的測定 參考Pal等[8]方法測定樣品的溶解度。首先,將經鹽析法純化得到的膠原凍干品溶解于0.5 mol/L乙酸中配制成濃度為6 mg/mL的膠原溶液。使用6 mol/L的氫氧化鈉或鹽酸溶液將樣品的pH調節至1～10。然后,將樣品溶液在4 ℃下攪拌30 min后在4 ℃下8603×g離心30 min。收集上清液,計算相對溶解度RS:

其中,Ps為上清液的蛋白質濃度;Pm是最高的蛋白質濃度。

1.2.3 Zeta電位的測定 參照程海明等[9]方法進行。將鱈魚皮膠原蛋白凍干品溶于0.5 mol/L乙酸中配成0.5 mg/mL的膠原溶液。使用1.0 mol/L的硝酸溶液和1.0 mol/L的氫氧化鉀溶液將上述溶液的pH調節至2～11。在4 ℃下測定樣品的Zeta電位值。樣品的等電點為Zeta電位值為零時對應的pH。

1.2.4 等電點沉淀法純化膠原蛋白粗提液 將1.2.1中提取得到的膠原粗溶液使用濃度為5 mol/L的氫氧化鈉和乙酸溶液調至pH7.0左右,靜置3 h后,4 ℃環境下8603×g離心30 min取沉淀,沉淀用0.5 mol/L的乙酸溶液復溶后透析48 h,期間每隔6 h換一次預冷透析液(蒸餾水),最后凍干得到等電點法純化膠原蛋白。

1.2.5 SDS-PAGE分析膠原純度 對等電點純化后的膠原進行SDS-PAGE分析。采用5%的濃縮膠和7.5%的分離膠。采用0.6 mol/L的Tris-HCl緩沖液(含有2%的SDS、0.1%的溴酚藍、25%的甘油和14.4 mol/L的β-ME,pH為6.8)為樣品緩沖液;染色液為0.1%的考馬斯亮藍溶液(考馬斯亮藍∶甲醇∶冰醋酸=9∶9∶2,v/v);脫色液按照水∶甲醇∶冰醋酸=8∶1∶1的比例配制。取凍干樣品1 mg溶于5%的SDS溶液中,按照1∶4(樣品:緩沖液1)的比例加入樣品緩沖液,沸水浴煮5 min,8603×g離心5 min后取10 μL上樣。同時取10 μL蛋白質Marker作為分子量的參考,10 μL上鼠尾Ⅰ型膠原作為對照。電泳過程采用直流恒壓電源,電壓為100 V。

1.2.6 結構特性分析 采用X-射線衍射、傅里葉紅外光譜和紫外吸收光譜對等電點純化后得到的膠原進行結構特性分析。

對樣品進行X-射線衍射分析。射線源為Cu靶Kα輻射,電壓為40 KV,電流為40 mA。掃描角度5°～50°(2θ),掃描速度為4°/min。掃描結果采用Origin 8.5作圖。

對樣品進行傅里葉紅外光譜分析。將溴化鉀烘干至恒重,取適量用瑪瑙研缽充分研磨,后用壓片機壓片,在500～4000 cm-1范圍內掃描,掃描的結果作為背景。后取適量等電點純化膠原凍干品和烘干溴化鉀充分研磨混勻(大約1∶100 g/g),在同樣波長范圍內掃描,分辨率為2 cm-1,掃描次數32次。

對樣品進行紫外吸收光譜分析。取凍干后的等電點純化膠原,溶解于0.5 mol/L的乙酸溶液中,配制成1 mg/mL的溶液。取0.5 mol/L的乙酸溶液用于基線的測定。采用紫外可見分光光度計在200～400 nm范圍內以中速掃描。

1.2.7 等電點沉淀法純化工藝的研究 采用不同沉淀時間、不同沉淀pH、不同膠原濃度,對膠原粗溶液進行純化,以確定最優純化工藝。

固定沉淀pH為7.0、膠原濃度為6 mg/mL,將沉淀時間分別定為0、1、2、3、6、24 h,4 ℃環境下8603×g離心30 min取沉淀,沉淀用0.5 mol/L的乙酸溶液復溶。測定復溶液的膠原蛋白濃度和總蛋白濃度,計算回收率和純度。

固定沉淀時間為3 h、膠原濃度為6 mg/mL,將膠原粗溶液的pH分別調至6.4、6.6、6.8、7.0、7.2,4 ℃環境下8603×g離心30 min取沉淀,沉淀用0.5 mol/L的乙酸溶液復溶。測定復溶液的膠原蛋白濃度和總蛋白濃度,計算回收率和純度。

固定沉淀時間為3 h、沉淀pH為7.0,將膠原粗溶液的濃度分別調至2、4、6、8、10 mg/mL,4 ℃環境下8603×g離心30 min取沉淀,沉淀用0.5 mol/L的乙酸溶液復溶。測定復溶液的膠原蛋白濃度和總蛋白濃度,計算回收率和純度。

1.2.8 回收率和純度的計算

回收率(%)=(復溶液羥脯氨酸含量/膠原粗溶液的羥脯氨酸含量)×100

純度以復溶液羥脯氨酸含量/復溶液總蛋白含量表示。

1.2.9 羥脯氨酸含量和總蛋白含量的測定 根據Sun等[10]的方法測定羥脯氨酸的含量。首先,取0.5 mL液體樣品加入0.5 mL的6 mol/L鹽酸(固體樣品取1～2 mg,加入1 mL的6 mol/L鹽酸)在110 ℃水解8 h,然后將水解產物徹底轉移并調至中性。使用10 μg/mL羥脯氨酸溶液作為標準溶液。經計算，羥脯氨酸標準曲線方程為：y=0.0939x+0.0129(R2=0.9991)。 取1 mL樣品溶液和標準溶液,加入1.5 mL無水乙醇和1 mL氯胺T,然后,在每個管中加入1 mL高氯酸反應5 min。最后,加入1 mL對二甲基氨基苯甲醛,置于60 ℃水浴中靜置20 min。冷卻反應溶液后用酶標儀測定560 nm處的吸光值?？偟鞍诇y定根據試劑盒采用BCA法。

1.3 數據處理

所有實驗均進行三次平行實驗,每次實驗平行測定三次。結果均采用Origin 8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 溶解度曲線

如圖1所示,鱈魚皮膠原在pH1～3時都是高度可溶的,并且在pH=3時溶解度最高。隨著pH的升高(pH3～pH7),溶解度急劇下降,并且在pH=7時溶解度最低。lvarez等[11]報道,當膠體系統接近其等電點時,分子的凈電荷將接近零。在這種情況下,分子間的靜電排斥最小,分子將發生聚集和沉淀。也就是說,蛋白質在其等電點時具有最小的溶解度。因此,鱈魚皮膠原的的等電點在7左右。此外,從pH9～11,樣品的溶解度有增加,Jongjareonrak等[12]報道,當pH遠離等電點時,膠原分子將攜帶更多的凈電荷,膠原分子之間的排斥力增高,溶解度也隨之增高。

圖1 pH對膠原蛋白溶解度的影響Fig.1 Effects of pH on the solubility of collagen from pacific cod skin

2.2 Zeta電位

如圖2所示,膠原蛋白分子的電荷在pH2～6時為正,在pH7～10時為負,并且在pH=6.83時凈電荷為零。根據先前的報道[13],在特定的pH下,膠原分子所帶的正電荷將等于負電荷,該pH即為膠原蛋白的等電點。因此,樣品的等電點為6.83,該結果與溶解度的結果一致。樣品的等電點處于弱酸性,這可能是因為膠原中谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸含量高[14]。

圖2 Zeta電位分析Fig.2 Zeta potential analysis of collagen

2.3 SDS-PAGE

根據圖3,圖譜中條帶清晰,無雜帶出現。這表示等電點純化得到的樣品純度較高,等電點純化法可以作為一種有效的純化方法。且樣品的電泳圖譜與鼠尾Ⅰ型膠原類似,均由至少兩種不同的α多肽鏈(α1和α2)組成。這些α鏈的分子量約為135 kDa。由圖3可以看出,α1帶的強度約為α2帶的兩倍。因此,鱈魚皮膠原蛋白的分子組成可表示為(α1)2α2。此外,在圖中還可以觀察到二聚體(β鏈)和三聚體(γ鏈),它們代表了膠原蛋白的分子間和分子內交聯[15]。這些β鏈的分子量約為245 kDa,而γ鏈的分子量一般大于245 kDa。樣品和鼠尾Ⅰ型膠原的電泳圖譜之間沒有實質性差異,這也證明了膠原的亞基或交聯未受pH的影響。

圖3 等電點純化膠原的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE pattern of collagen purified by isoelectric precipitation method注:M為高分子蛋白marker泳道; A為等電點純化膠原泳道;B為鼠尾Ⅰ型膠原泳道。

2.4 結構性質分析

2.4.1 等電點純化膠原的X-射線衍射(X-RD)分析 根據圖4,等電點純化得到的膠原具有兩個主要的衍射峰。對應的衍射角(2θ)分別為7.4°,22.3°。根據布拉格方程d(?)=λ/2sinθ(其中λ是X射線波長,θ 是布拉格衍射角)可以計算出衍射峰對應的最小重復面間距d。計算出d值分別為11.93?和3.98?。Giraud-Guille等[16]研究表明,第一個衍射峰反映了膠原纖維分子鏈之間的距離,其值在12?左右，第二個衍射峰反映了由膠原纖維引起的彌漫性散射,其值在4?左右。該結果與文獻報道一致,說明等電點純化膠原的三螺旋結構仍保持完整。

圖4 等電點純化膠原的X-射線衍射Fig.4 X-ray diffraction of collagen purified by isoelectric precipitation method

2.4.2 等電點純化膠原的傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析 由圖5所示,等電點純化得到的樣品具有五個典型的酰胺帶。酰胺A帶出現在3308 cm-1。正如Doyle等[17]報道的那樣,酰胺A帶與N-H伸縮振動有關,發生在3400～3440 cm-1范圍內,最終在氫鍵形成后轉移到3300 cm-1附近,這有助于維持膠原蛋白的三螺旋結構。此外,分別在2933和1655 cm-1處觀察到酰胺B帶和酰胺I帶。通常出現在1550～1600 cm-1范圍內且主要與N-H彎曲振動有關的酰胺Ⅱ帶[18]出現在1543 cm-1。由C-N伸縮振動產生的酰胺III帶出現在1232 cm-1。上述發現與其他相關研究相似[19-20]。

圖5 等電點純化膠原的傅里葉變換紅外光譜Fig.5 FTIR spectra of collagen purified by isoelectric precipitation method

2.4.3 等電點純化膠原的紫外吸收光譜分析 如圖6所示,等電點純化后的膠原在234 nm處有最大紫外吸收,這是膠原的典型吸收波長[19]。根據Sun等[20]的研究,紫外吸收與-COOH,-CONH2基團和C=O的n→π*躍遷有關。此外,苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸分別在250、270和280 nm附近有最大紫外吸收[21]。然而,該樣品在275 nm處僅有微小的吸收,而在280 nm處沒有吸收,這表明樣品中含有微量的酪氨酸但沒有色氨酸,這也進一步證明樣品的純度很高。

圖6 等電點純化膠原的紫外吸收光譜Fig.6 Ultraviolet absorption spectrum of collagen purified by isoelectric precipitation method

2.5 等電點沉淀最優工藝的確定

由圖7A可以看出,隨著時間的延長,回收率和純度均呈現出先上升后趨于平穩的趨勢。在6 h時,回收率達到85%左右。此時羥脯氨酸/總蛋白的比值為0.0875。綜合兩個指標,選擇6 h作為最適沉淀時間。由此也可以看出,等電點沉淀較鹽析沉淀在時間上有較大優勢。而對于工業化生產來說,時間的降低就相當于成本的降低。

由圖7B可以看出,隨著pH的升高,回收率和純度均呈現出先上升后下降的趨勢。在pH=6.8時,回收率最高,為90.05%,這個結果也與溶解度和Zeta電位的結果一致。此時羥脯氨酸/總蛋白的比值為0.092。純度在pH=7.0時達到最大,但此時回收率有明顯的下降。綜合兩個指標,當工業要求產品純度較高時,選擇pH=7.0作為最適pH;當要求回收率最大時,選擇pH=6.8作為最適pH。

由圖7C可以看出,隨著膠原蛋白濃度的升高,回收率和純度均呈現出先上升后下降的趨勢。在膠原濃度為6 mg/mL時,回收率和純度均達最高,回收率為85.12%,此時羥脯氨酸/總蛋白的比值為0.089。因此選擇6 mg/mL作為最適膠原濃度。對于膠原濃度大于6 mg/mL后出現的下降現象,推測可能是因為此時膠原溶液濃度過高,溶液的黏度過大,導致酸或堿的加入很難中和膠原分子所帶的電荷。

圖7 不同沉淀時間、pH和膠原濃度對回收率和純度的影響Fig.7 Effects of sediment time,pH and collagen concentration on the recovery yield and purity注：A：沉淀時間；B:pH；C：膠原濃度。

在上述最優條件(pH6.8,沉淀6 h,6 mg/mL)的基礎上進行了驗證實驗,回收率為了85.62±1.01%,羥脯氨酸含量/總蛋白含量為0.0872。若按羥脯氨酸和膠原蛋白間的換算系數11.1計算,純度可達96.79%±1.12%。因此,該優化條件準確。

3 結論

溶解性曲線和Zeta電位法聯合確定了鱈魚皮膠原蛋白的等電點。利用等電點沉淀的原理純化了鱈魚皮膠原蛋白。結果顯示樣品的純度較高,且三螺旋結構保持完整。這說明等電點純化法可以作為一個有效的辦法應用于鱈魚皮膠原蛋白的純化。優化結果顯示，在pH=6.8，膠原蛋白濃度為6 mg/mL時，沉淀6 h，回收率能達到85.62%±1.01%，羥脯氨酸含量/總蛋白含量能達到0.087。 等電點純化法能大大減少后期透析的時間,節約了時間成本,這將有利于膠原蛋白的工業化生產。