細點圓趾蟹蟹肉酶解液制備美拉德型蟹風味料工藝優化

劉佳夢,白 苗,張邵鴻,李統政,竹 琳,方旭波,,*,陳小娥,

(1.浙江海洋大學食品與醫藥學院,浙江舟山 316022; 2.浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室,浙江舟山 316022)

細點圓趾蟹(Ovalipespunctatus)隸屬于梭子蟹科,圓趾蟹屬,俗稱“沙蟹”,盛產于我國黃、東海,是浙江沿海地區常見經濟蟹種類,屬廣溫、廣鹽性種類[1-2]。細點圓趾蟹常被加工成冷凍切蟹、冷凍蟹肉和蟹肉罐頭等產品,由此帶來大量的含蟹肉下腳料或碎蟹肉[3]。

美拉德反應(Maillard reaction)是食品熱加工生產過程中常用的一種方法,其本質是蛋白質的氨基基團和還原糖的羰基基團相互作用,是一種常見的非酶褐變反應[4-5]。該反應的反應機理復雜,目前還不能完全解釋清楚[6]。研究表明美拉德反應不僅可使產品產生特殊的色澤與風味,還在食品穩定性和貨架期等方面起著重要作用[7-8]。目前對于細點圓趾蟹的研究主要集中在蒸煮液風味物質分析或酶解工藝優化方面,國內尚未有關于以細點圓趾蟹蟹肉酶解液為原料制備美拉德型蟹風味料的相關報道。胡小超等[9]以細點圓趾蟹酶解液為原料,利用正交試驗確定蟹肉酶解肽-鋅螯合最優條件,為細點圓趾蟹的高值化利用提供了依據;余輝等[10]利用電子鼻技術確定細點圓趾蟹蒸煮液濃縮前β-環糊精最佳添加量,對其真空濃縮工藝進行優化,在最佳條件下得到的濃縮汁蟹風味濃郁;卜俊芝等[11]研究細點圓趾蟹加工水煮液的營養成分及其風味物質,證明細點圓趾蟹適宜于制備以甜味和鮮味為主要特征的海鮮調味料。

本文以細點圓趾蟹蟹肉酶解液為原料,以感官評分為指標,考察反應溫度、谷氨酸添加量、加熱時間、pH和還原糖添加量對感官評分的影響,結合響應面試驗確定最優美拉德反應條件,對蟹風味料氨基酸成分進行測定,并采用SPME-GC-MS(固相微萃取-氣相-質譜聯用)對蟹風味料揮發性風味物質進行分析,為美拉德型蟹風味料的開發及建立風味評價體系提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

細點圓趾蟹 購于舟山國際水產城;葡萄糖、木糖、谷氨酸 國藥集團化學試劑有限公司;其他試劑均為分析純。

PHS-3B精密pH計 上海精密科學儀器有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海棱光技術有限公司;BS110S電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;RE-52CS-1旋轉蒸發 上海亞榮生化儀器廠;YXQ-LS-50G壓力蒸汽滅菌器 上?？茣钥茖W儀器有限公司;75 μm CAR/PDMS SPME(固相微萃取)裝置 美國Supelco公司;Finnigan Trace氣相色譜質譜聯用儀 美國Finnigan公司;DB-WAX毛細管柱 30 m×0.25 mm×0.25 μm,美國J&W科學公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細點圓趾蟹蟹肉酶解液制備 參考李晶等[12]的實驗方法。細點圓趾蟹取蟹肉后粉碎勻漿,液料比(v/w)3∶1,調節pH至7.5,加酶量1200 U/g,50 ℃水解3.5 h(加入胰蛋白酶1.2 h后,加入風味蛋白酶),酶的復合比為2∶1(胰蛋白酶∶風味蛋白酶)。酶解結束后迅速置于沸水浴中5 min滅酶,冷卻至室溫后5000 r/min條件下離心10 min,取上清液為細點圓趾蟹蟹肉酶解液。

1.2.2 美拉德型蟹風味料的制備 參考袁林等[13]的研究方法,在錐形瓶中加入蟹肉酶解液100 mL,添加一定量的谷氨酸和一定量的還原糖(木糖∶葡萄糖2∶1),調整至一定的pH,放入高壓滅菌鍋在一定溫度下反應一段時間得到美拉德型蟹風味料,待其冷卻后進行感官評定。

1.2.3 美拉德反應單因素試驗 反應溫度(110、115、120、125、130 ℃)、谷氨酸添加量(1%、2%、3%、4%、5%)、加熱時間(20、30、40、50、60 min)、pH(5、6、7、8、9)、還原糖添加量(1%、2%、3%、4%、5%)為單因素進行試驗,研究不同因素對感官評分的影響。其余各因素固定為還原糖添加量3%、反應溫度為115 ℃、反應時間為30 min、pH7、谷氨酸添加量3%、酶的復合比2∶1。

1.2.4 響應面法優化美拉德反應條件 在單因素試驗的基礎上,選擇感官評分最佳時的固定還原糖和谷氨酸添加量,以感官評分為響應值,選取試驗結果極差較大的反應溫度、加熱時間和pH為響應因素,采用軟件Design-Expert V8.0.6設計三因素三水平的響應面分析試驗,對蟹風味料美拉德反應條件進行優化,試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and level of response surface test

1.3 實驗指標測定

1.3.1 感官評分指標 選擇10名有相關感官評定知識且身體素質良好,視覺系統、嗅覺系統以及視覺系統正常的食品科學與工程專業學生。由這10名學生組成評定小組,以滋味、氣味、外觀三項為評價指標,對蟹風味料進行感官評分,評定時采用先看再聞后嘗,滿分100分,滋味40分、氣味30分、外觀30分,去除異常數值,取剩余數值平均值,平均值數值越高,說明蟹風味料品質越好,評分標準如表2。

表2 蟹風味料感官評分標準(分)Table 2 Sensory evaluation criteria for crab flavor(score)

1.3.2 SPME-GC-MS測定方法 參考葉夢迪等[14]實驗方法進行。

1.3.2.1 SPME方法 取5 mL美拉德反應產物于20 mL專用頂空瓶中,50 ℃萃取30 min,然后將老化后的萃取頭插入頂空瓶內,距液面1 cm,在50 ℃條件下吸附30 min,取出后與GC進樣口相連,解析3 min后進行GC-MS分析。

1.3.2.2 GC條件 DB-WAX毛細管柱(規格:30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣:He(99.999%);柱流速:1.0 mL/min,不分流進樣;柱溫:初溫35 ℃保持3 min,2 ℃/min升至150 ℃,然后再以4 ℃/min升至250 ℃,保持10 min;進樣口溫度:250 ℃。

1.3.2.3 MS條件 離子源:EI;離子源溫度:230 ℃;四級桿溫度:150 ℃;質量掃描范圍:33～500 amu。

1.3.2.4 揮發性物質的鑒定 將樣品色譜圖中的每個峰與Willey和NIST數據庫中的已知化合物的質譜數據進行比對,正反匹配度均大于850的物質予以報道。

1.3.3 氨基酸成分分析 按胡燃等[15]實驗方法進行。取5 mL美拉德反應物于水解管內,加入6 mol/L鹽酸5 mL,抽真空,使用酒精噴燈灼燒水解管分口,在110 ℃恒溫干燥箱中水解24 h,冷卻后過濾水解液,將其轉移到50 mL容量瓶中定容。取濾液1 mL于5 mL容量瓶內,用40～50 ℃真空干燥器干燥后,殘留物用1～2 mL水溶解,最后在50 ℃恒溫干燥箱中蒸干,取1 mL pH2.2的緩沖液溶解后用氨基酸自動分析儀進行測定。

1.4 數據處理

每組試驗重復三次,試驗數據以“平均值±標準差”形式表示采用Origin Pro 9.1軟件繪圖,響應面試驗利用軟件Design Expert V8.0.6進行試驗結果分析。

2 結果與分析

2.1 美拉德反應單因素試驗

2.1.1 反應溫度對美拉德反應產物的影響 反應溫度是美拉德反應的重要因素。由圖1可以看出,隨著溫度升高,感官評分在120 ℃時達到最高值,此時蟹風味濃郁,色澤棕黃。其原因可能是,溫度較低時,美拉德反應產物香味沒有完全揮發出來,蟹肉中原有的腥味也暴露出來,對產品風味和滋味產生較大影響;溫度過高時,產生雜味物質,使產品帶有不良風味。因此選擇120 ℃比較適宜。

圖1 反應溫度對美拉德反應產物的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on Maillard reaction products

2.1.2 谷氨酸添加量對美拉德反應產物的影響 由圖2可知,在谷氨酸添加量1%～3%時,感官評分增幅明顯,美拉德反應產物氣味、滋味等都有顯著提升;添加量超過3%,感官評分幾乎不再變化。其原因可能是,美拉德反應在還原糖與氨基酸之間進行,由于試驗中還原糖的添加量固定,過量的氨基酸無法和還原糖進行反應,對產物的感官評分影響較弱[16],因此選擇3%的谷氨酸添加量作為最佳反應條件。

圖2 谷基酸添加量對美拉德反應產物的影響Fig.2 Effect of the amount of glutamic acid addition on Maillard reaction products

2.1.3 加熱時間對美拉德反應產物的影響 由圖3可見,隨著加熱時間延長,感官評分呈現先增高再降低趨勢。由感官評定可知,加熱時間20～30 min,產品色澤變深,產品風味也愈發濃郁;在30 min時,美拉德反應產物色澤棕黃,蟹風味濃郁,反應物料基本反應完全,感官評分最高。超過30 min時,反應生成焦香味物質和揮發性氣體,這些物質會掩蓋蟹肉原有的特殊風味,影響感官評分。曹治云等人[17]研究發現美拉德反應溫度較高,加熱時間過長時會生成類黑精,該產物能夠致癌。綜合考慮,反應時間選擇30 min較為適宜。

圖3 加熱時間對美拉德反應產物的影響Fig.3 Effect of heating time on Maillard reaction products

2.1.4 pH對美拉德反應產物的影響 由圖4所示,隨著pH變化,感官評分先上升后下降。其原因可能是,美拉德反應處于酸性環境時,氨基質子化,阻礙了羰氨反應的發生,故產品風味和色澤受到一定的影響;當美拉德反應處于堿性環境時,較酸性環境下能更順利地進行,pH越高,生成的褐色物質越多,產品色澤加深[18-20]。相比之下,中性pH條件時,產品色澤棕黃,蟹風味濃郁,感官評分最高。因此pH7條件較為適宜。

圖4 pH對美拉德反應產物的影響Fig.4 Effect of pH on Maillard reaction products

2.1.5 還原糖添加量對美拉德反應產物的影響 由圖5可知,隨著還原糖添加量的增加,感官評分呈先上升后下降的趨勢。當還原糖添加量在1%～3%時,隨著還原糖添加量的增加,香氣逐漸濃郁,色澤加深,感官評分升高;超過3%時,評分開始下降,其原因可能是,未能參與羰氨反應的還原糖在高溫下產生苦味物質對口感產生影響[21]。因此選擇還原糖添加量為3%作為最佳反應條件。

圖5 還原糖添加量對美拉德反應產物的影響Fig.5 Effect of reducing sugar addition on Maillard reaction products

2.2 響應面法優化美拉德反應條件

2.2.1 回歸模型的確定及響應面分析 利用Design Expert V8.0.6對表3的響應面試驗結果進行回歸擬合,得到感官評分模型的二次多項回歸方程為:

表3 響應面法優化美拉德試驗條件設計及結果Table 3 Optimization of Maillard test condition design and results by response surface methodology

Y=79.39+4.35A+2.44B+1.27C+1.33AB-0.24AC-1.14BC-5.32A2-6.60B2-7.57C2

表4 感官評分回歸模型Table 4 Sensory score regression model

2.2.2 響應面圖分析 若響應面坡度陡峭,則說明響應值對該因素變化敏感,兩者間交互作用越強;若響應面坡度相對較平緩,說明該因素對響應值影響不大,兩者間交互作用較弱。研究任兩個因素交互作用對蟹風味料感官評分時,固定另一因素在0水平,從而得到三維響應面圖。如圖6～圖8所示,觀察可得:圖6、圖7中A軸即反應溫度軸上響應面值相比加熱時間和pH更為陡峭,因此反應溫度因素對感官評分影響更大;圖8中C軸即pH軸上響應面坡度更為平緩,說明感官評分對加熱時間的變化更為敏感。響應面圖分析結果與方差分析結果一致:A(反應溫度)>B(加熱時間)>C(pH)。

圖6 反應溫度與加熱時間對感官評分影響的響應面Fig.6 Response surface plot for the effect of reaction temperature and heating time on sensory score

圖7 反應溫度和pH對感官評分影響的響應面Fig.7 Response surface plot for the effect of reaction temperature and pH on sensory score

圖8 加熱時間和pH對感官評分影響的響應面Fig.8 Response surface plot for the effect of heating time and pH on sensory score

2.2.3 驗證試驗結果 運用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行優化預測,得出在試驗因素水平范圍內預測蟹肉酶解液美拉德反應最優工藝條件為,反應溫度122.26 ℃,加熱時間33.76 min,pH7.09,感官評分預測值為80.49分。根據實際可行情況調整條件為,反應溫度122 ℃,加熱時間33 min,pH7,進行3次驗證試驗,實際測得的感官評分為(79.61±0.12)分,與模型預測值較接近,相對偏差僅為1.09%,表明用響應面法優化得到的蟹肉酶解液美拉德反應條件可靠。

2.3 氨基酸分析

由表5可以看出,在最優美拉德反應條件,即122 ℃下,調整pH至7,加熱33 min,制得的蟹肉酶解液美拉德反應產物中共檢測出17種氨基酸,氨基酸總含量為26.718 g/100 g,其中必需氨基酸含量為9.272 g/100 g,占總氨基酸含量的34.70%,甜味氨基酸和鮮味氨基酸含量占總氨基酸含量的85.98%。各種氨基酸根據其特征呈現不同的風味,其中亮氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸占總氨基酸含量的14.93%,能使海鮮調味料香氣濃郁[22]。

表5 蟹肉酶解液美拉德反應物氨基酸含量分析Table 5 Analysis of amino acid content of Maillard reaction product with crab hydrolysate

2.4 揮發性物質研究

經優化的最優實驗條件下制得蟹肉酶解液美拉德反應產物,采用SPME-GC-MS對其進行測定,測得其總離子流程圖如圖9所示,揮發性物質組成及相對含量見表6。

圖9 蟹風味料揮發性物質總離子流程圖Fig.9 Crab flavor volatiles total ion flow chart

表6 美拉德型蟹風味料SPME-GC-MS鑒定結果及分析Table 6 SPME-GC-MS identification result and analysis of Maillard crab flavor

續表

2.4.1 醛類物質 醛類物質占總揮發性物質含量的1.858%。醛類物質閾值較低,因而對產品風味有較大影響。醛類物質通常來自于脂肪氧化,具有脂肪香味[23],其中含量最高的壬醛具有柑橘、玫瑰等香氣,有較強的油脂氣味[14]。辛醛、壬醛和己醛主要來源于不飽和脂肪酸,如亞麻酸、油酸、花生四烯酸等的氧化[24],本實驗所采用的細點圓趾蟹是常見海產蟹類,含有多種不飽和脂肪酸,較易氧化產生辛醛、壬醛和己醛此類物質。

2.4.2 酮類物質 酮類物質占總揮發性物質含量的3.625%。酮類貢獻果香和甜花香風味,通常隨著碳鏈的增長貢獻出更強的花香特征[25],其中烯酮類能夠提供濃烈的似玫瑰葉香[26]。又因酮類物質閾值略高于醛類物質,因此相較而言此類物質對于蟹風味料的風味貢獻值也較大。

2.4.3 醇類物質 醇類物質占總揮發性物質含量的5.967%。醇類一般呈香甜味、花香味或土腥味,但醇類物質閾值高,對食品風味貢獻較小,揮發性物質中所檢測出來的醇類基本來源于脂肪氧化[27],其中飽和醇由于閾值較高,幾乎不對產品風味起影響作用;某些不飽和醇類能對產品風味起到一定的貢獻,但其貢獻值較低可忽略不計。

2.4.4 芳香類物質 芳香類物質占總揮發性物質含量的5.527%。芳香類物質一般是Tyr、Phe等苯環氨基酸的降解產物,其中苯酚對產品風味有一定的不良影響,但其相對含量較低,一般來自環境污染。

2.4.5 含N/S/O雜環化合物 含N/S/O雜環化合物占總揮發性物質含量的14.945%,其中吡嗪類物質所占總比例較高,尤以2,6-二甲基吡嗪含量最高,達到7.656%,占到該類雜環化合物的52.25%。該物質閾值較低,能夠為蟹風味料提供宜人的烤香、堅果和海鮮肉香味[28-29]。此外,吡啶類物質占該類雜環化合物的3.23%,但吡啶類物質閾值極低,低含量即能產生令人愉悅的味道。故含N/S/O雜環化合物對蟹風味料風味貢獻較大。

2.4.6 其他化合物 其他化合物主要是指酯類和碳氫類物質,此類物質閾值較高,對產品風味影響較小。這些物質共占總揮發性物質的29.548%,其中乙酸甲酯比重最高,占總揮發性物質的10.96%,酯類物質能為食品提供柔和的水果香味和花香味[30],使得蟹風味料具有更加豐富的風味。碳氫類物質一般被認為對香氣無特殊貢獻,但有些可能會形成雜環化合物的重要中間體,有助于提高整體風味[31]。

3 結論

通過單因素和響應面法對細點圓趾蟹蟹肉酶解液美拉德反應條件進行優化,得出最優美拉德反應條件為反應溫度122 ℃,谷氨酸添加量3%,加熱時間33 min,初始pH7,還原糖(木糖∶葡萄糖=2∶1)添加量為3%,感官評分(79.61±0.12)分,與模型預測值80.49分,相對偏差值僅1.09%,表明結果真實可靠。在此條件下制備的蟹風味料,滋味鮮美,蟹風味濃郁,色澤棕黃。對蟹風味料揮發性物質進行SPME-GC-MS檢測可以得出,其特征性風味物質可能為吡嗪類物質,該類物質閾值較低,能為蟹風味料提供怡人的烤肉香味和海鮮風味。因此,美拉德反應不僅能夠改善蟹肉酶解液風味,也為新型海鮮調味料的開發提供了依據。