分光光度法測定花生殼中總黃酮含量的研究

趙 星,李云建,韓 偉,張夢瑤,劉斯婕,李玉榮

(1.石家莊學院化工學院,河北石家莊 050035; 2.河北省農林科學院糧油作物研究所,河北石家莊 050035)

花生,又名落花生,是我國主要的油料作物,2016年我國花生年產量已達1728.98萬噸,居世界首位[1]。目前,我國花生的開發利用仍以花生仁榨油為主,約占花生果重量三分之一的花生殼,僅有少量被加工成飼料和制成化工原料,利用率低,造成極大的資源浪費?；ㄉ鷼ぶ谐写掷w維、粗蛋白、粗脂肪、糖類以及礦物質等成分外,還含有多種黃酮類成分,如木犀草素、香葉木素、5,7,3′,4′-tetrahydroxy-8-prenyflavone、圣草酚、5-羥基-色原酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、5,7,3′-trihydroxy-4′-methoxy-8-prenylflavone、大風子素、racemoflavone、5,7-二羥基色原酮等,以木犀草素含量最高[2-4]。研究表明,從花生殼中提取黃酮類化合物并生產的“脈舒膠囊”,具有良好的降血壓、降血脂作用[1,5],而花生的品種、產地等因素均會影響花生殼中總黃酮的含量[6-7],因此,建立并優化出適當的檢測方法對花生殼中總黃酮的開發利用與質量控制尤為重要。

總黃酮的含量測定一般采用分光光度法,包括直接測定法和可見區絡合法,直接測定法由于被測溶液的基底易產生干擾,所以可見區絡合法應用較多,如鹽酸-鎂粉法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、AlCl3法等[8-9]。目前,花生殼中總黃酮的測定多采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法[10],然而,測定過程中尚存在樣品與對照溶液絡合后的光譜圖差別較大等問題[11],由于中藥成分復雜,測定總部位時干擾成分多,為了保證測定的專屬性、靈敏度與準確度,以對照品與供試品共有吸收波長為檢測波長進行含量測定為佳,選擇適宜的對照品與適宜的絡合方法顯得尤為重要。然而,不同絡合方法測定花生殼中總黃酮含量的適應性研究卻未有相關報道。因此,本實驗選用蘆丁和木犀草素兩種常見對照品為參考,從方法適應性、方法重復性、供試品溶液穩定性方面比較測定總黃酮含量的三種常用絡合方法,選出測定花生殼中總黃酮含量的最佳方法并進行方法學驗證,為花生殼的進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生 購自河北省滄州市;木犀草素(純度≥98%) 上海金穗生物科技有限公司;蘆丁(純度≥98%) 合肥博美生物科技有限責任公司;無水乙醇 分析純,天津市百世化工有限公司;亞硝酸鈉 分析純,天津市河東區紅巖試劑廠;硝酸鋁 分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;氫氧化鈉 分析純,天津市恒興化學試劑制造有限公司;無水氯化鋁 分析純,天津市永大化學試劑有限公司;無水乙酸鈉、冰乙酸 分析純,天津市歐博凱化工有限公司;濃鹽酸 分析純,武漢市鑫華松化工有限公司;鎂粉 分析純,北京求賢化工廠;蒸餾水 實驗室自制。

WH-71型電熱恒溫干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;BJ-800A中藥粉碎機 德清拜杰電器有限公司;FA2004B型電子天平 上海天美天平儀器有限公司;SB-5200DTD型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;LDZ4-12型低速自動平衡離心機 北京京立離心機有限公司;TGL-16G型高速離心機 上海安亭科學儀器廠;TU-1950雙光束可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;NewClassic MF分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司;HH-1數顯恒溫水浴鍋 金壇市順華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的制備 分別取蘆丁、木犀草素對照品適量,精密稱定,置于25 mL量瓶中,以75%乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得濃度分別為339、299 μg/mL的儲備液,于4 ℃冷藏保存,備用,臨用前以75%乙醇稀釋至所需濃度。

1.2.2 樣品溶液的制備 將花生殼洗凈,干燥,粉碎,過60目篩,干燥至恒重。取花生殼粉末適量,精密稱定,置于50 mL EP管中,精密加入75%(v/v)乙醇30 mL,潤濕,室溫下浸泡2 h,超聲波輔助提取(50 Hz,200 W)30 min后,離心(4000 r/min)10 min,分離上清液再次離心(12000 r/min)20 min,取上清液,即得樣品溶液。

1.2.3 鹽酸-鎂粉法 取花生殼粉末1 g,精密稱定,其余按照1.2.2制備樣品溶液。參考文獻[12]方法,精密量取此樣品溶液、113 μg/mL蘆丁對照品溶液、299 μg/mL木犀草素對照品溶液各500 μL,分別置于有300 mg鎂粉的具塞刻度試管中,將試管置于冷水浴(15 ℃)中,緩緩滴加3 mL濃鹽酸,并不時振搖試管。待反應充分后加入75%乙醇至7 mL,置于沸水浴中加熱60 min,取出,迅速冷卻至室溫,用75%乙醇補足至7 mL,搖勻,于350～700 nm下進行全波長掃描。精密量取75%乙醇500 μL,按上述過程操作,作為空白對照,即得樣品溶液、蘆丁對照品溶液、木犀草素對照品溶液鹽酸-鎂粉法全波長掃描圖。以水代替濃鹽酸,同法操作,即得未經絡合樣品溶液全波長掃描圖。

1.2.4 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法 取花生殼粉末1.5 g,精密稱定,其余按照“1.2.2 樣品溶液的制備”項下操作制備樣品溶液。參考文獻[13-14]方法,精密量取此樣品溶液、339 μg/mL蘆丁對照品溶液、299 μg/mL木犀草素對照品溶液各500 μL,分別置于5 mL棕色量瓶中,加入5% NaNO2溶液150 μL,搖勻,靜置6 min后,加入10% Al(NO3)3溶液150 μL,搖勻,靜置6 min后,加入4% NaOH溶液2 mL,用水稀釋至刻度,搖勻,轉移至離心管中,室溫離心(12000 r/min)3 min后,分離上清液,于350～700 nm下進行全波長掃描。精密量取75%乙醇500 μL,按上述過程操作,作為空白對照,即得樣品溶液、蘆丁對照品溶液、木犀草素對照品溶液NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法全波長掃描圖。以水代替Al(NO3)3溶液,同法操作,即得未經絡合樣品溶液全波長掃描圖。

1.2.5 AlCl3法 取花生殼粉末1 g,精密稱定,其余按照“1.2.2 樣品溶液的制備”項下操作制備樣品溶液。參考文獻[8]方法,精密量取此樣品溶液、170 μg/mL蘆丁對照品溶液、74.8 μg/mL木犀草素對照品溶液各500 μL,分別置于5 mL棕色量瓶中,加入0.1 mol/L AlCl3溶液250 μL,醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH5.5)500 μL,用75%乙醇稀釋至刻度,搖勻,靜置15 min,于350～700 nm下進行全波長掃描。精密量取75%乙醇500 μL,同法操作,作為空白對照,即得樣品溶液、蘆丁對照品溶液、木犀草素對照品溶液AlCl3法全波長掃描圖。以水代替AlCl3溶液,按上述過程操作,即得未經絡合樣品溶液全波長掃描圖。

1.2.6 方法學驗證 按照《中國藥典》2015版《藥品質量標準分析方法驗證指導原則》的相關要求進行操作[15]。

2 結果與分析

2.1 鹽酸-鎂粉法適應性考察

采用鹽酸-鎂粉法獲得的蘆丁對照品溶液、木犀草素對照品溶液、樣品溶液、未經絡合樣品溶液全波長掃描圖,如圖1所示。由圖1可知,采用鹽酸-鎂粉法制備的供試品溶液的全波長掃描圖在370～550 nm之間存在兩個吸收峰,其中最大吸收波長為423 nm,而未經絡合樣品溶液的全波長掃描圖在此區間未出現吸收峰,二者的區別說明花生殼提取物中黃酮類成分在該試驗條件下已發生絡合反應。蘆丁對照品的最大吸收波長為390 nm,與供試品的匹配性差。木犀草素對照品在400～550 nm之間存在兩個吸收峰,且最大吸收波長為422 nm,與供試品相匹配,其圖譜在350～395 nm之間吸光度出現負值,推測是由于溶液中較大濃度的木犀草素(299 μg/mL)消耗了反應體系中大量的鎂離子,而鎂離子在此波段具有吸收而形成。由此可見,鹽酸-鎂粉法可用于測定花生殼中總黃酮的含量,應選擇木犀草素為對照品,測定波長423 nm,此時,樣品中其他成分對測定的干擾小。

圖1 鹽酸-鎂粉法全波長掃描圖Fig.1 Full wavelength scanning of Mg-HCl method

2.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法適應性考察

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法獲得的蘆丁對照品溶液、木犀草素對照品溶液、樣品溶液、未經絡合樣品溶液全波長掃描圖如圖2所示。由圖2可知,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法制備的供試品溶液全波長掃描圖在400～650 nm之間存在吸收峰,且其在440～520 nm范圍內吸光度曲線平緩,吸收峰不明顯,而未經絡合樣品溶液的全波長掃描圖在400～650 nm之間呈現下降趨勢,二者的差異說明花生殼提取物中黃酮類成分在該試驗條件下已發生絡合反應,且在吸收峰處,絡合前后吸光度差值小(ΔA<0.270)。為了盡可能排除樣品中非黃酮類成分對測定結果的干擾,使方法具有更好的專屬性,應選擇供試品與未經絡合樣品溶液吸光度差值最大處作為測定波長,即519 nm(ΔAmax=0.269)。蘆丁與木犀草素對照品在450～650 nm之間存在吸收峰,其最大吸收波長分別為514與510 nm。由此可見,NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法可用于測定花生殼中總黃酮的含量,測定波長519 nm時,樣品中其他成分對測定干擾較小,木犀草素與蘆丁均可作為對照品,且木犀草素較蘆丁更適合。

圖2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法全波長掃描圖Fig.2 Full wavelength scanning of NaNO2-Al(NO3)3-NaOH method

2.3 AlCl3法適應性考察

采用AlCl3法獲得的蘆丁對照品溶液、木犀草素對照品溶液、樣品溶液、未經絡合樣品溶液全波長掃描圖如圖3所示。由圖3可知,采用AlCl3法制備的供試品溶液全波長掃描圖在380～500 nm之間存在吸收峰,其最大吸收波長為402 nm,未經絡合樣品溶液的全波長掃描圖在350～500 nm之間吸光度明顯下降,二者的差異說明花生殼提取物中黃酮類成分在該試驗條件下已發生絡合反應。蘆丁對照品的最大吸收波長為417 nm,木犀草素對照品的最大吸收波長為408 nm,故AlCl3法可用于測定花生殼中總黃酮的含量,應選擇木犀草素為對照品,測定波長402 nm,此時,樣品中其他成分對測定干擾較小。

圖3 AlCl3法全波長掃描圖Fig.3 Full wavelength scanning of AlCl3 method

2.4 三種絡合方法重復性的比較

取同一花生殼粉末,分別采用鹽酸-鎂粉法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、AlCl3法項下操作,測定波長分別為423、519、402 nm,平行6份,計算吸光度的相對標準偏差(RSD,%)。由同一分析人員使用同一臺分光光度計進行方法的重復性比較,結果如表1所示。

表1 三種絡合方法的重復性試驗結果Table 1 Investigation on repeatability of three complexing methods

經比較后發現,采用三種方法測定花生殼提取物中總黃酮的含量,方法重復性以AlCl3法最佳(RSD<1%),其余依次為NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、鹽酸-鎂粉法。研究發現,鹽酸-鎂粉法操作過程較繁瑣,極易引入偶然誤差,因此方法重復性最差,且耗時長,反應過程需濃鹽酸,亦存在一定危險性;NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法操作相對簡便,方法重復性較鹽酸-鎂粉法好,但反應后的供試品溶液易產生渾濁,需經微孔濾膜過濾或高速離心后才能準確測定,操作較繁瑣;AlCl3法操作簡便,且方法重復性好,能夠滿足分析方法的測定要求[12]。由此可見,AlCl3法在測定花生殼中總黃酮含量時的方法重復性明顯優于鹽酸-鎂粉法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法。

2.5 三種絡合方法穩定性的比較

將采用鹽酸-鎂粉法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、AlCl3法項下制備的供試品溶液,于室溫下放置0、5、10、20、40、60 min后測定吸光度,測定波長分別為423、519、402 nm,以時間為橫坐標,吸光度為縱坐標作圖,結果如圖4所示。

圖4 三種絡合方法的穩定性試驗結果Fig.4 Investigation on stability of three complexing methods

由圖4可知,采用鹽酸-鎂粉法制備的供試品溶液在室溫放置20 min內吸光度波動較大(RSD=7.85%),20 min后,吸光度雖略有降低,但曲線平穩,可有效減少乃至消除因供試品放置時間或測定順序的不同而產生的測定誤差(RSD=0.49%),故建議在采用鹽酸-鎂粉法測定花生殼中總黃酮含量時,供試品溶液于室溫下靜置20 min后測定。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法制備的供試品溶液的吸光度在0～60 min內呈現逐漸下降的趨勢,穩定性差(RSD=9.69%),因此測定過程中,需嚴格控制供試品溶液的放置時間,才能有效減少乃至消除由此產生的系統誤差。采用AlCl3法制備的供試品溶液的吸光度在0～60 min內幾乎無變化(RSD=0.43%),穩定性好。由此可見,AlCl3法在測定花生殼中總黃酮含量時供試品溶液的穩定性明顯優于鹽酸-鎂粉法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法,不易因放置時間或測定順序的不同而引入誤差,有利于大批量樣品的同時測定。

2.6 三種絡合方法的評價

蘆丁是自然界中廣泛存在的黃酮類成分,NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法即源自于蘆丁的含量測定,后來被逐步應用于黃酮類化合物的測定[8],因此,可采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法,將總黃酮的含量以蘆丁為對照品計,測定與比較不同中藥總黃酮的含量。木犀草素為花生殼中含量豐富的黃酮類活性成分[3,16],研究發現,無論采用何種絡合方法,同蘆丁相比,木犀草素絡合后的吸收峰均與花生殼中總黃酮更為接近,因此,采用絡合方法測定花生殼中總黃酮的含量,可首選木犀草素作為對照品。

鹽酸-鎂粉法在15 ℃水浴中,利用黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇在鹽酸-鎂粉作用下被還原,生成橙紅到紅紫色物質。整個過程需控制濃鹽酸的加入速度并不時振搖刻度試管,以控制鹽酸和鎂粉反應的劇烈程度與顯色劑和樣品的接觸程度[17],過程較為嚴苛,且因使用濃鹽酸而具備一定的危險性,不適用于大批量樣品的同時測定,且本研究發現,在三種絡合方法的比較中,該方法測定花生殼中總黃酮含量的重復性相對較差,不宜作為首選方法。

NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法和AlCl3法的原理均是利用黃酮類化合物與Al3+形成的絡合物。NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法并非黃酮類化合物的專屬反應,凡具有鄰苯二羥基的物質,均能用此法進行絡合顯色[18]。AlCl3法則是在酸性條件下,Al3+只與酮羰基及其臨位的羥基發生絡合,生成黃色絡合物,其反應過程如圖5所示[8],可有效減少乃至消除具有鄰二酚羥基結構的非黃酮類化合物的干擾,專屬性更強。同時,本研究發現,在所選條件下,測定花生殼提取液中總黃酮的含量,料液比1∶15 g/mL制備的花生殼樣品溶液經NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法顯色后,吸光度在0.4左右,而料液比1∶30 g/mL制備的花生殼樣品溶液與74.8 μg/mL木犀草素對照品溶液經AlCl3法顯色后,吸光度已達0.5左右,由此可見,AlCl3法的靈敏度更高,在朗伯-比爾定律的最佳區域內易獲得更寬的線性范圍;另一方面,NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法供試品溶液的穩定性差,在測定過程中,需嚴格控制放置時間,才能有效減少乃至消除由此產生的系統誤差,不適用于大批量樣品的同時測定。

綜合比較三種絡合方法后發現,以木犀草素為對照品,測定波長為402 nm時,AlCl3法的靈敏度高、專屬性好、重現性好、穩定性高,且操作簡便快速,成本低廉,適用于大批量樣品的同時測定,可作為花生殼中總黃酮含量測定的首選方法。

2.7 AlCl3法的方法學驗證

2.7.1 標準曲線與線性范圍 精密量取濃度分別為19.9、39.9、59.8、79.7、100.0 μg/mL的木犀草素對照品溶液500 μL,按照“1.2.5 AlCl3法”項下操作,于402 nm下測定吸光度。以木犀草素對照品濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,如圖6所示,線性方程為y=0.0078x-0.0099(r=0.9997),表明該方法在木犀草素濃度為19.9～100 μg/mL濃度范圍內,與吸光度成良好線性關系。

圖6 木犀草素標準曲線Fig.6 Luteolin standard curve

2.7.2 精密度試驗 取同一供試品溶液,于402 nm下測定吸光度,連續6次,計算吸光度的RSD=0.16%,表明儀器精密度良好。

2.7.3 重復性試驗 取同一樣品溶液,按照“1.2.5 AlCl3法”項下操作,于402 nm下測定吸光度,平行6次,計算吸光度的RSD=0.96%,表明該方法重復性良好。

2.7.4 加樣回收率試驗 精密量取重復性試驗項下所用的樣品溶液250 μL,精密加入濃度為99.7 μg/mL的木犀草素對照品溶液170 μL和75%乙醇80 μL,其余按照“1.2.5 AlCl3法”項下操作,于402 nm下測定吸光度,平行6次,結果如表2所示?；厥章试?7%～103%范圍內,RSD=2.36%,表明該方法準確度良好。

表2 AlCl3法回收率試驗結果Table 2 Investigation on recovery of AlCl3 method

2.7.5 穩定性試驗 取同一供試品溶液,室溫放置0、5、10、20、40、60 min后,于402 nm下測定吸光度,結果如表3所示,供試品溶液在0～60 min內穩定性良好(RSD=0.43%)。

表3 AlCl3法穩定性試驗結果Table 3 Investigation on stability of AlCl3 method

3 結論

采用光譜分析技術,比較了鹽酸-鎂粉法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、AlCl3法對花生殼中總黃酮含量的測定效果,發現同蘆丁相比,更宜采用木犀草素為對照品。鹽酸-鎂粉法測定花生殼中總黃酮含量時,操作繁瑣苛刻,耗時長,重復性差;NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法供試品溶液穩定性差,且其他成分易干擾測定結果,靈敏度也較低。因此,測定花生殼中總黃酮含量的首選方法為AlCl3法,經方法學驗證,測定波長402 nm時,木犀草素在19.9～100 μg/mL濃度范圍內與吸光度成良好的線性關系,該方法專屬性好,靈敏度高,準確度高,重復性好,穩定性高,且操作簡便快速,成本低,適用于大批量花生殼樣品中總黃酮含量的測定。本文可為花生殼中黃酮類成分的深入研究及其在功能食品和藥品方面的質量控制提供參考。