皖北地區窖泥類芽孢桿菌發酵風味物質的研究

吳文睿,劉飛翔,方頌平,蒲順昌

(亳州學院生物與食品工程系,安徽亳州 236800)

濃香型白酒以其典型風格,深受廣大消費者喜愛,它占據著我國白酒市場份額的70%[1-2]。窖泥是濃香型白酒生產釀造過程中的基礎物質之一,為釀酒微生物提供了豐富的營養物質,也是具有生香功能微生物的富集場所[3]。窖泥中長期馴化的微生物種群及其代謝產物相互制約、相互協調、相互作用,為酒體香味物質的形成提供反應底物,為濃香型白酒質量和典型風格的形成奠定基礎[4]。

近年來,隨著食品風味各種分析儀器的快速發展,我國研究人員對白酒中的各種風味物質及其形成機理進行了深入的研究。許多學者,從酒醅和窖泥中分離得到相關功能性微生物,并對其發酵后的風味物質進行分析,以探究其在白酒釀造中的作用。例如,鐘姝霞等[5]從醬香型酒醅中篩選出5株芽孢桿菌,并采用氣相-質譜聯用分析技術(GC-MS)對其發酵后代謝產物進行分析,結果表明:主要產物為3-羥基-2-丁酮,以及少量的2,3-丁二醇和酯類等芳香物質。趙輝等[6]從白酒窖泥中篩選及鑒定了高產己酸的三株細菌,已應用于窖池保養及人工窖泥培養。楊春霞等[7]從牛欄山二鍋頭酒醅中分離篩選出5株芽孢桿菌,并對其發酵后的風味物質進行分析,結果顯示其代謝產物均含有十幾種風味物質,且含有許多重要的酯類物質。

我國安徽北部地區由于季風明顯,氣候溫和,光照充足,雨量適中,無霜期長,四季分明,春溫多變,夏雨集中,秋高氣爽,冬長且干的獨有的天然地理環境,聚集著許多的白酒生產基地,在香型類別上均屬于濃香型白酒,其中以古井、金種子、高爐家和文王等為代表[8]。我們已對皖北地區的窖泥微生物進行分離,得到許多窖泥微生物的菌種,許多是濃香型白酒重要功能性微生物。目前對白酒的微生物研究多集中在芽孢桿菌、酵母等釀造功能菌上,對窖泥中類芽孢桿菌的研究較少,通過對類芽孢桿菌的研究,可探索類芽孢桿菌菌種代謝產物與酒中風味物質的關系。本實驗選取其中分離得到的類芽孢桿菌屬Paenibacilluslautus(P.lautus)、Paenibacilluswynnii(P.wynnii)、Paenibacillustarimensis(P.tarimensis)進行研究,采用固相微萃取法對三株類芽孢桿菌株的發酵液進行萃取,然后采用GC-MS分析檢測其發酵液中風味物質的組成,通過分析具有產風味物質能力菌株的代謝產物,探求各菌種代謝產物與酒中風味物質的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

類芽孢桿菌菌種:P.lautus、P.wynnii、P.tarimensis從皖北地區窖泥中分離鑒定。

TOMY SX-70高壓滅菌鍋 日本TOMY;Heratherm IMH400-S生化培養箱 美國Heratherm;MaxQ 485HP震蕩培養箱 美國Thermo;Allegra 64R高速離心機、Agilent PC420固相微萃取儀 美國安捷倫科技有限公司;Waters I-Class/Xevo TQD氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS) 美國沃特世科技有限公司(Waters);CAR/PDMS 75 μm頂空固相萃取頭 美國SUPELCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配方 菌種活化培養基:蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、葡萄糖3%、氯化鈉0.05%、硫酸銨0.09%、硫酸鐵0.01%、硫酸鎂0.03%、氯化鈣0.5%、酒醅浸提液、瓊脂2%、pH7.0。

種子培養培養基:蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、葡萄糖3%、氯化鈉0.05%、硫酸銨0.09%、硫酸鐵0.01%、硫酸鎂0.03%、氯化鈣0.5%、酒醅浸提液、pH7.0。

發酵培養基:糖化液(玉米、高粱、大米)9%、蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、硫酸銨0.09%、硫酸鎂0.03%、pH7.0。

1.2.2 發酵液的制備 菌種活化:將保藏菌種接種于菌種活化培養基斜面上,35 ℃條件下活化24 h。

種子培養:從經活化后的新鮮試管斜面上取兩環菌種,接種到裝有15 mL種子培養基的25 mL搖瓶中,在35 ℃,140 r/min條件下培養24 h,制備種子液。

發酵培養:取上述種子液15 mL接種于發酵培養基(250 mL的三角瓶,裝液量150 mL)中,在140 r/min,35 ℃條件下搖床培養72 h。以接種15 mL種子培養基作為空白對照。

1.2.3 發酵液的前處理 菌種發酵液GC-MS分析的前處理:吸取發酵液與無水乙醇按1∶1比例混合均勻后,靜置30 min,在10 ℃條件下離心,轉速3000 r/min,離心10 min,取上清液先進行粗過濾,再用0.22 μm的水相濾膜過濾,得濾液,用移液管吸取濾液8 mL加入到頂空瓶中,稱取氯化鈉3.0 g加入到頂空瓶中,并加入一顆攪拌磁子,設置磁力攪拌器溫度為50 ℃,轉速400 r/min,PDMS萃取頭頂空萃取30 min。

1.2.4 氣相色譜質譜聯用儀分析 氣相質譜聯用儀分析條件:不分流流速0.9 mL/min;進樣口溫度:230 ℃;升溫程序:35 ℃保持4 min,以2 ℃/min升溫到60 ℃不保持,以6 ℃/min 升溫到180 ℃保持15 min;色譜與質譜接口溫度:230 ℃;電離方式:電子轟擊源(EI);檢測方式:全掃描模式;電離能量:70 eV。

1.3 數據處理

經過氣相色譜-質譜聯用儀進樣分析后,使用儀器Chemstation數據處理軟件,對樣品全分析譜圖進行解析,導出樣品中風味物質的峰面積,計算面積百分比。

2 結果與分析

2.1 整體風味化合物分布情況

按照實驗方法,將類芽孢桿菌屬的3株菌的發酵液和空白培養基經固相微萃取等前處理后,用GC-MS分析其風味化合物的種類以及相對含量,總離子色譜圖見圖1～圖4。由總離子色譜圖可知,3株類芽孢桿菌屬菌的發酵液中的風味化合物種類數量明顯高于空白對照。

圖1 空白培養基氣質分析總離子色譜圖Fig.1 GC-MS total ions chromatogram of blank medium

圖2 Paenibacillus wynnii發酵液氣質分析總離子色譜圖Fig.2 GC-MS total ions chromatogram of flavor compounds in the fermentation of Paenibacillus wynnii

圖3 Paenibacillus tarimensis發酵液氣質分析總離子色譜圖Fig.3 GC-MS total ions chromatogram of flavor compounds in the fermentation of Paenibacillus tarimensis

圖4 Paenibacillus lautus發酵液氣質分析總離子色譜圖Fig.4 GC-MS total ions chromatogram of flavor compounds in the fermentation of Paenibacillus lautus

由圖5分析可知,三株類芽孢桿菌屬的發酵風味物質種類主要集中在酯類、醇類、醛酮類和雜環類四類上,這些化合物與白酒中的微量成分種類基本一致[9]。其中,P.wynnii和P.lautus發酵的風味物質中,酯類和醇類的相對含量較高;而P.tarimensis發酵的風味物質中,雜環類化合物的相對含量較高。酯類和醇類物質是白酒中微量成分占比比較大,為濃香型白酒中主體香貢獻較大。雜環類(酚類、呋喃類等)化合物雖在白酒中的成分極微量,但其閾值往往較低,對白酒的典型風格香味上仍有較高的貢獻[10]。

圖5 類芽孢桿菌屬發酵液的風味化合物分布情況Fig.5 The distribution of flavor compounds in the fermentation by Paenibacillus

2.2 主要風味物質分析

由表1可知,P.wynnii、P.tarimensis和P.lautus的發酵液中分別鑒定出58、26和39種風味化合物。P.wynnii主要發酵產物是3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(4-乙烯基愈創木酚)、己酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯等,其產酯物質較多,酯類物質是酒中的主要的呈香物質,而且己酸乙酯是濃香型白酒的主體香[11]。P.tarimensis主要發酵產物是2,4-二叔丁基苯酚、3-羥基2-丁酮、2,3-丁二醇、2-甲氧基苯酚、2.3-二氫苯并呋喃、己酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、香葉醇、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(4-乙烯基愈創木酚)等。P.lautu主要發酵產物是2,3-丁二醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、己酸己酯、棕櫚酸乙酯等,產酯物質較多。酯類化合物是白酒中除乙醇和水以外含量最多的一類組分。它約占總組分含量的60%,白酒中酯類化合物多以乙酯形式存在。在白酒的香氣特征中,絕大部分是以突出酯類香氣為主的。在酒體中,一些含量較高的酯類,由于它們的濃度及氣味強度占有絕對的主導作用,使整個酒體的香氣呈現出以酯類香氣為主的氣味特征,并表現出某些酯原有的感官氣味特征。濃香型白酒中的已酸乙酯,在酒體中占有主導作用,使濃香型白酒的香氣呈現出以己酸乙酯為主的香氣特征。

表1 類芽孢桿菌屬菌發酵液氣質分析結果Table 1 The analysis of GC-MS results of flavor compounds in the fermentation by Paenibacillus

續表

P.wynnii和P.tarimensis的發酵產物中均有較高含量的3-羥基-2-丁酮,相對含量分別為12.65%和14.17%。3-羥基-2-丁酮又名乙偶姻,是令人喜愛的食用香料,具有特有的奶油香味,在酒中是一種重要的芳香成分,賦予酒的濃厚,可使酒產生優良的風味[12]。此外,許多研究表明3-羥基-2-丁酮是四甲基吡嗪的重要前體物質,并且在這兩株菌中的發酵液中均檢測到了四甲基吡嗪的存在,這可能是以3-羥基-2-丁酮為前體物質轉化而來[13-15]。P.wynnii、P.tarimensis和P.lautus均含有較高的2,3-丁二醇,其含量分別為22.21%、11.67%和40.30%。研究表明,2,3-丁二醇是白酒中重要的多元醇之一,是主要甜味芳香物質,能使酒醇厚綿甜,有自然感[16]。

P.tarimensis的發酵產物還含有較高的雜環類化合物,如2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(4-乙烯基愈創木酚,12.54%)、2-甲氧基苯酚(8.50%)、2.3-二氫苯并呋喃(7.04%)等。一直以來,酒中的酚類化合物被認為是飲料酒中有重要貢獻的香氣物質[17]。其中4-乙烯基愈創木酚主要存在于玉米酒精發酵的揮發物中,其感官閾值很低,僅為0.3 mg/L,痕量存在時也能呈現發酵香氣、酚味、藥香味、丁香味或煙熏味、略帶甜味,是決定酒類、醬油、茶葉、干酪、咖啡等食品的主要香味成分,也是日化、醫藥、香精合成等行業較為常用的高檔香料之一[18-19]。白酒中含有3-羥基-2-丁酮、2.3—丁二醇,被認為它是白酒質量的重要成分,在白酒中起著緩沖、平衡的作用,能是酒產生優良的酒香和綿甜的口味,同時白酒中3-羥基-2-丁酮及2.3-丁二醇是呈甜味物質,并有助香作用,特別是在回味上使之有醇厚感,能使酒醇厚綿甜,有自然感。

3 討論與結論

以皖北地區窖泥中的類芽孢桿菌屬菌P.wynnii、P.tarimensis和P.lautus為研究對象,通過檢測分析發現,這三株菌株均是很好的窖泥功能菌。P.wynnii和P.lautus的發酵液中分別鑒定出58和39種風味化合物,且以酯類物質為主;P.tarimensis的發酵液中分別鑒定出26種風味化合物,主要以具有芳香味雜環類化合物為主;此外,3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇和4-乙烯基愈創木酚等也有較高相對含量,它們也均是白酒中的重要呈香呈味物質,這些菌產生的主要香氣成分是白酒重要的香味物質,對白酒是香氣貢獻是正向。因此,從窖泥中篩選到的類芽孢桿菌屬的發酵代謝產物與酒中主要風味物質的關聯較大,研究結果可為進一步深入研究濃香型白酒的風味物質形成機制、微生物代謝機理、發酵生產工藝及技術改進等提供一定的理論和技術支持。