酸角果肉多糖的提取工藝優化與初級結構分析

胡浩，郭瑞，李季楠，吳雪嬌，吳艷

（上海交通大學農業與生物學院，上海200240）

酸角，又名酸豆，羅望子（Tamarindus indica L.），為豆科酸角屬[1]。酸角原產自非洲，主要分布在印度、緬甸等國，在我國主要分布于廣西、福建、四川、海南和云南等省份[2-3]。酸角果實由果皮、果肉、種子以及纖維組成，其中果肉占比45%～55%[4]，果肉含有酒石酸、還原糖、纖維和單寧等，同時富含礦物質及維生素[5]，酸角果肉的制備物具有抗氧化[6]、抗菌性[7]和抗糖尿病[8]等作用，是酸角中最有價值的部分。國內外學者多研究酸角果肉的營養成分及功能，而對于酸角果肉多糖（polysaccharides from Tamarindus indica L.Pulp fruit，PFTP）的提取及結構的研究很少。

王玲[9]研究了熱水浸提法制備PFTP 的最佳參數，研究說明在浸提溫度 90 ℃、液料比 30∶1（mL/g）、pH為6.0、浸提時間為90 min 時，提取條件最優，多糖得率達17.18%。然而傳統的熱水浸提法提取多糖，不但提取率低、能耗大，且提取的時間較長，會對多糖的結構造成一定程度的破壞。超聲波輔助提取法的空化作用，引發機械性震動等次級效應，促使胞內的溶質進一步釋放；同時具有條件溫和、提取時間短等優點，可大大提高提取得率[10-11]，故在多糖的制備中有著較普遍的應用。

通過超聲波輔助提取法制備酸角果肉中的多糖，探索提取時間、超聲功率、提取溫度與液料比四因素與提取得率的關系，后采用響應面分析法改進其工藝參數。探索超聲波輔助提取法與熱水浸提法提取酸角果肉多糖的異同，結合紫外光譜分析（ultraviolet spectrum，UV）、紅外光譜分析（infrared spectrum，IR）與離子色譜法等方式對PFTP 的結構進行初步解析，為酸角果肉的研究利用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

酸角：來源于貓哆哩集團（云南）有限責任公司。剝離果肉后干燥，粉碎成粉后備用。

無水乙醚、無水乙醇、硫酸、葡萄糖、苯酚：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

旋轉蒸發儀：R206B 型，上海申生科技有限公司；高速粉碎機：SF-2000 型，上海市藥材有限公司；臺式低速離心機：TD5A-WS，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；紫外可見分光光度計：U1810 型，北京普析通用儀器有限責任公司；傅里葉紅外光譜儀：Nicolet 6700 型，蘇州佐藤精密儀器有限公司；數控超聲波提取機：THC 型，濟寧天華超聲電子儀器有限公司；真空冷凍干燥機：VFD-2000 型，上海比朗儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：HWS24 型，上海恒科學儀器有限公司；高效液相色譜儀：Waters e2695，美國沃特世公司。

1.2 方法

1.2.1 PFTP 的超聲波輔助制備過程

干燥酸角果肉→無水乙醚→乙醇→超聲波→旋轉蒸發→乙醇沉淀→丙酮、乙醇依次沖洗→復溶→真空冷凍干燥→酸角果肉多糖

酸角果肉多糖的制備：將酸角果肉充分干燥，粉碎后加入10 倍體積的無水乙醚，攪拌1 d，更換無水乙醚2 次，烘干后得到脫脂的酸角果肉；再向酸角果肉中添加10 倍的95%乙醇，浸泡1 d，可除去低聚糖以及小分子等物質，烘干后得到預處理的酸角果肉粉。

取4 g 酸角果肉處理粉，以去離子水為溶劑，依照不同的超聲時間、液料比與超聲功率進行超聲，再進行低速離心，將所得沉淀按照同等條件復提1 次，合并兩次所得上清液，將上清液進行旋轉蒸發，后加入95 %乙醇溶液，4 ℃下放置12 h，沉淀析出多糖，分別利用丙酮、乙醇沖洗若干次，離心后將沉淀加水復溶，離心除去復溶液中的蛋白質和雜質，最后對上清液進行冷凍干燥，即得到酸角果肉多糖。

1.2.2 酸角果肉多糖的熱水制備過程

干燥酸角果肉→無水乙醚→乙醇→熱水浸提→旋轉蒸發→乙醇沉淀→丙酮、乙醇依次沖洗→復溶→真空冷凍干燥→酸角果肉多糖

熱水浸提酸角果肉多糖的前處理同1.2.1 所述，烘干得到預處理酸角果肉粉，后稱取4 g 酸角果肉處理粉，按照王玲[9]優化的提取工藝參數進行提取，經低速離心，復提，合并上清液，旋蒸，向所得液中加入4 倍體積的95%乙醇，靜置12 h 后析出多糖，分別用丙酮、乙醇洗滌，離心后將沉淀加水復溶，進行高速離心，最后對所得的上清液進行冷凍干燥，即得到熱水浸提的酸角果肉多糖。

1.2.3 PFTP 得率計算方式

使用苯酚-硫酸法[12]。標準品為葡萄糖溶液，得率計算方法如下所示：

式中：C 為多糖質量濃度，μg/mL；V 為提取液的體積，mL；n 為提取液稀釋倍數；m 為所取的干燥前處理粉質量，g。

1.2.4 單因素試驗

進行初級試驗后，確定單因素試驗各變量的區間范圍。本試驗利用去離子水作為溶劑，分別研究提取時間、超聲功率、提取溫度以及液料比4 項因素的大小與PFTP 提取得率的變化關系。

1.2.5 響應面試驗設計

基于單因素試驗，設置自變量為提取時間（A）、超聲功率（B）、提取溫度（C）與液料比（D），響應值為PFTP 得率，利用Design expert 8 程序設定四因素三水平響應面組合試驗，并優化其超聲波輔助提取的工藝參數。具體試驗因素水平如表1 所示。

表1 響應面試驗因素與水平表Table 1 Table of factors＆level in response surface analysis

1.2.6 PFTP 的紫外光譜分析

配置熱水浸提酸角果肉多糖與PFTP 溶液各0.2 mg/mL，進行紫外光譜掃描，波長范圍為：190 nm～400 nm。

1.2.7 PFTP 的紅外光譜分析

分別取1.0 mg 熱水浸提酸角果肉多糖與PFTP，與KBr 充分混勻，進行紅外光譜掃描，區域范圍為：4 000 cm-1～400 cm-1。

1.2.8 PFTP 的單糖組成研究

準確稱取5 mg PFTP 樣品于5mL的具塞試管內，加入 1mL2 mol/L 三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA），121 ℃烘箱中水解2 h，用水定容至50 mL，通過0.45 μm微孔濾膜后供進樣分析[13]。

使用高效陰離子交換色譜法，設置檢測條件為檢測器：脈沖安培檢測器；色譜柱：CarboPac PA20；流動相：A，H2O；B，250 mmol/L NaOH；C，1 mol/L NaAc；流速：0.5 mL/min。

1.2.9 PFTP 的分子量測定

使用高效體積排阻色譜法（high performance size exclusion chromatography，HPSEC） 測定 PFTP 的分子量，儀器裝備紫外檢測器（UV）、示差折光檢測器（refractive index detector，RI）以及激光直角光散射檢測器（right angle laser light scattering detector，RALLS）等。色譜柱：TSK gel G6000 PWXL（13）7.8 ×300+TSK gel G6000 PWXL（10）7.8 ×300，柱溫：35 ℃，流動相：0.15 mol/L NaNO3+0.05 mol/L NaH2PO4·2 H2O，流速：0.5 mL/min，洗脫時間：60 min，數據分析軟件ASTRA 6.1。

1.2.10 PFTP 糖醛酸的定量檢測

當多糖中含有較多的糖醛酸時，利用硫酸-咔唑法檢測其含量會受到中性糖的影響，不能反映其含量的真實值[14-15]，本試驗采用改良的間羥聯苯法[16]測定PFTP 的糖醛酸含量。

配置超聲波輔助提取所得的PFTP 溶液1 mg/mL，利用半乳糖醛酸配置所需標準樣品，得到標準曲線，利用間羥聯苯法準確檢測糖醛酸的真實含量。

1.2.11 數據處理

進行3 次平行試驗，檢測多糖溶液的吸光度值，得率如1.2.3 公式計算，利用Excel 與Design expert 8 軟件分析處理數據。

2 結果與分析

2.1 PFTP的單因素試驗結果

PFTP 的單因素試驗結果如圖1 所示。

圖1 單因素與PFTP 得率的關系曲線Fig.1 Relationship between independent variables and extraction yield of PFTP

2.1.1 超聲提取時間對PFTP 得率的影響

由圖1a 可知，在 10 min～40 min 區間內，PFTP 得率與時間呈正相關，時間大于40 min 后，得率開始下降。這可能是因為10 min～40 min 區間內，超聲波對細胞的作用時間增加，導致細胞裂解破碎，使多糖的溶出更充分；同時，溶劑與多糖的不斷接觸，加快了多糖的擴散速度，得率隨之增加。提取時間過長時，多糖的結構可能發生破壞而成為單糖，不溶性的物質也會在細胞破裂后懸浮在溶劑中，使其滲透性下降[17-18]，造成多糖含量減少。故本研究選取提取時間為40 min。

2.1.2 超聲提取功率對PFTP 得率的影響

由圖1b 可知，當超聲功率為200 W 時，得率最大，超聲功率在200 W～360 W 時，得率與超聲功率呈反相關?？赡茉谝欢ù笮〉墓β蕝^間內，超聲波的空化作用與破壁效應與超聲波功率呈正相關，加速細胞壁的分解并通過微噴射形成和聲流促進細胞內物質溶出；超聲功率過大時，可能會導致局部溶液瞬時溫度過熱，使多糖裂解、黏度下降等，同時可能會導致空化期間溶劑中的氣泡數量增加，從而降低傳輸到介質中的超聲能量的效率，導致多糖得率開始下降[19-20]。故本研究選取超聲功率為200 W。

2.1.3 超聲提取溫度對PFTP 得率的影響

由圖1c 可知，溫度在 30 ℃～50 ℃區間內，PFTP 得率與溫度呈正相關，50 ℃時達到最高，50 ℃～70 ℃區間內，隨溫度增加，PFTP 得率逐漸下降。這可能是因為溫度在50 ℃以下時，多糖未能充分溶解，溫度升高導致超聲波空化效應及多糖擴散效果顯著增強，故得率逐漸增加。當溫度超過50 ℃時，由于溫度過高，一方面可能造成部分多糖的分解，另一方面高溫會導致表明張力下降和微氣泡內蒸氣壓的增加，導致超聲波阻尼效應的產生，使得率有所下降[21-22]。故本研究選取提取溫度為50 ℃。

2.1.4 液料比對PFTP 得率的影響

由圖1d 可知，液料比在 10∶1（mL/g）～30∶1（mL/g）區間內，得率隨著液料比的增加而增加，在30∶1（mL/g）～50∶1（mL/g）的區間，得率隨著液料比的增加而逐漸下降。這可能是因為隨料液比的逐漸上升，多糖擴散的壓力差變大，有利于多糖的擴散溶解，得率增大；隨溶劑的繼續增加，溶劑與原料的高比例延長了朝內部組織擴散的距離，提取液中超聲波能量密度分布的減少是其主要的影響因素，通過阻礙多糖的溶解而對提取率造成反向影響，空化作用也可能隨著介質黏度的增強而更難產生，故得率略微下降[22-23]。本研究選取液料比 30∶1（mL/g）。

2.2 PFTP超聲波輔助提取的響應面分析

2.2.1 響應面分析的試驗結果

基于單因素試驗的結論，選定提取時間、超聲功率、提取溫度和液料比4 個因素，分別記作A、B、C、D，得率記作Y，在單因素最優值的基礎上采用四因素三水平設計，響應值為PFTP 得率，使用Design-Expert 8.0 程序中的Box-Behnken 原理進行響應面的試驗設計，響應面試驗組別及對應結果見表2 所示，共計29個組別。

表2 PFTP 的響應面試驗設計和得率Table 2 Response surface experimental design and extraction yield of PFTP

續表2 PFTP 的響應面試驗設計和得率Continue table 2 Response surface experimental design and extraction yield of PFTP

通過Design-Expert 8.0 的數據處理，得到PFTP 得率與4 個變量的多元回歸方程如下：

Y=31.16+1.82A+1.96B+2.56C+1.14D-0.21AB-0.51AC-0.30AD-0.36BC-1.24BD+1.22CD-3.71A2-5.12B2-4.04C2-3.91D2

如表3 所示可知，回歸模型P＜0.000 1，證明此模型極為顯著，各因素與其響應值之間顯著相關。A、B、C、D 的P 值皆小于0.000 1，表明這4 項單因素對PFTP的得率都有著極為顯著的影響，BD、CD 的 P＜0.05，表明此兩項交互項對得率有著顯著的影響；根據F 值判斷，4 項因素對PFTP 影響程度從大到小排序為：C＞A＞B＞D。模型多重相關系數R2=0.984 0，亦證明了模型相關性良好，是準確的；失擬項的P 值為0.121 5，失擬項不顯著，故回歸模型可以接受[18]。

表3 響應面分析試驗回歸模型-方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

綜上所述，該回歸模型可很好的應用于分析PFTP的超聲波輔助制備方法。

2.2.2 超聲波輔助提取PFTP 得率的響應面分析結果

響應面分析可得到等高線圖以及3D 曲面圖，結果如圖2 所示。等高線圖可清晰表征各參數與響應值的關系強弱，以得出最優參數。通過觀察響應面3D 圖曲面的坡度與等高線的密度，可以得出兩因素交互作用的顯著程度。一般影響程度與坡度、等高線、橢圓化程度成正相關。隨著變化坡度變化幅度的增加，曲面圖的顏色會逐漸加深[24]。

圖2 交互作用對得率的影響Fig.2 The effect of interaction on extraction yield

從圖2 中可以看出，對PFTP 得率影響最顯著的因素為C（提取溫度）與A（提取時間），圖中顯示為曲線較陡，顏色較深；B（超聲功率）次之，D（液料比）影響最小。

2.2.3 最佳提取條件的確定與驗證

根據上述多元回歸方程，利用模型預測其理論最優提取條件是：在53.25 ℃溫度下，使用206.41 W 超聲，液料比 32∶1（mL/g），提取 42 min、此參數條件下PFTP 得率可達32.01%?？紤]到實際應用可行性，選取最佳參數：50 ℃下，200 W 功率超聲40 min、液料比30∶1（mL/g）。

在上述優化條件下，3 次平行試驗得出PFTP 平均得率為31.94%，與理論預測值相近，表明此回歸方程能準確反映以上4 項因素對PFTP 提取得率的影響，同時表明響應面法改進的制備參數可用于實際應用。

2.3 超聲波輔助提取PFTP與熱水浸提PFTP的得率對比

由文獻[9]條件，90 ℃下提取 90 min、令 pH 為 5.0、液料比為20∶1（mL/g），此時熱水浸提酸角果肉多糖的得率最大；在此條件下，按照1.2.2 提取酸角果肉多糖，得出平均得率為23.44 %，大于文獻中的得率17.18%，這可能與原材料處理方式等不同有關。具體對比如表4 所示。

表4 超聲波輔助提取PFTP 與熱水浸提PFTP 得率的對比Table 4 Yield of PFTP by ultrasonic extraction and traditional hot water extraction

由表4 可知，超聲波輔助提取法的溫度較低，時間較短，可較大程度提高提取得率。由此可知，超聲波輔助提取法較熱水浸提法效益更高，更加節約能源，有較大的應用價值。

2.4 PFTP的紫外光譜吸收

PFTP 的紫外光譜吸收結果如圖3 所示。

由圖3 PFTP 和熱水浸提酸角果肉多糖的紫外吸收光譜圖可知，在190 nm 左右，二者皆出現較明顯吸收峰，為多糖特有吸收峰。在280 nm 左右，二者都出現一個較弱的吸收峰，這表明兩種提取方式所取得的樣品中都具有少量蛋白質，經檢測，其蛋白質含量分別為1.30%與1.78%。在260 nm 左右無吸收峰，表示樣品中無核酸[25]。兩種提取方式所得PFTP 的紫外吸收光譜圖形態上基本相同。

圖3 超聲波輔助提取PFTP 與熱水浸提PFTP 的紫外吸收光譜Fig.3 UV spectra of PFTP extracted by ultrasonic and hot water

2.5 PFTP的紅外光譜吸收

PFTP 的紅外光譜吸收結果如圖4 所示。

圖4 超聲波輔助提取PFTP 與熱水浸提PFTP 的紅外吸收光譜Fig.4 IR spectra of PFTP extracted by ultrasonic and hot water

由圖4 可知，3 600 cm-1～3 200 cm-1處具有明顯寬峰，為 O-H 的伸縮振動，3 000 cm-1～2 800 cm-1的峰是由于C-H 的伸縮振動，上述兩區域的峰是糖的特征吸收峰，PFTP 與熱水浸提酸角果肉多糖都具備此特征峰。1 880 cm-1與1 733 cm-1吸收峰是C=O 伸縮振動，1 601 cm-1處的峰為C=O 非對稱伸縮振動，1 407 cm-1處的峰是C-O 伸縮振動，1 339 cm-1處的峰為C=O對稱伸縮振動，1 300 cm-1～1 000 cm-1范圍內的峰為C-O 變角振動，表明PFTP 含有羧基結構。1 150 cm-1～1 060 cm-1范圍內的峰為C-O 伸縮振動所致。879 cm-1處是 β 吡喃糖 C-H 變角振動吸收峰；904 cm-1與843 cm-1處的吸收峰表明PFTP 具有葡萄吡喃糖結構[16]。790 cm-1和 688 cm-1處的峰是 C-H 面外吸收振動所致，480 cm-1～620 cm-1區域的峰是 C-X 的伸縮振動所致。

紅外光譜分析表明，超聲波輔助提取的PFTP 具有糖醛酸，在1 733 cm-1和1 259 cm-1的吸收峰，表明有-COOR 存在，說明PFTP 是一種酸性多糖[16]。

通過PFTP 與熱水浸提酸角果肉多糖的紅外圖譜可知，熱水浸提酸角果肉多糖的紅外光譜C=O 伸縮振動峰消失，O-H 變角振動峰數目減少，PFTP 在1 601、1 733、1 258 cm-1處有強吸收峰，表明其具有一定的羧基與酯基。熱水浸提酸角果肉多糖在1 733 cm-1處無明顯吸收峰，表示其羧基中C=O 非對稱伸縮結構大量減少，1 620 cm-1與1 262 cm-1處的峰變弱，表明熱水浸提法可能對酯基、羧基造成較大的破壞[26]?？傮w看來，熱水提取的PFTP 峰的數量大大減少，同時峰的程度有所減弱，對PFTP 的羧基以及主鏈結構等的破壞較大，可能使酸角果肉多糖甲酯化程度減弱。

2.6 超聲波輔助提取PFTP的單糖組成

對比各單糖標樣的出峰時間與面積，結果見圖5。

圖5 PFTP 的高效陰離子交換色譜Fig.5 High performance anion exchange chromatogram of PFTP

由圖5 可知，超聲波輔助提取所得PFTP 主要由阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、鼠李糖（Rha）、巖藻糖（Fru）、木糖（Xyl）、葡萄糖（Gal）和半乳糖醛酸（GalA）組成，其中阿拉伯糖、半乳糖與葡萄糖含量最多，故葡聚糖與阿拉伯半乳聚糖或為PFTP 的主要多糖成分，相應單糖的摩爾比為 45.56∶15.67∶6.41∶1∶5.14∶14.27∶1.95。

2.7 分子量測定結果

PFTP 的分子量測定結果表明，PFTP 的重均分子量為8.262×105g/mol，分散程度可用Mw/Mn 的比值表示，Mw/Mn 為1 時，表明多糖的組分均一，分子量分布較窄，其值越大，則分子量分布越寬，分散度越大[27]；PFTP 的Mw/Mn 值為1.248，說明PFTP 的分子量分布較為均一。

2.8 糖醛酸測定結果

采用間羥聯苯法測定糖醛酸含量，標準曲線測定結果如圖6 所示。

圖6 糖醛酸含量的標準曲線Fig.6 Standard curve of uronic acid content

線性回歸方程為y=0.002 8x+0.006 7，線性系數R2=0.991，即兩變量具有良好的相關性，根據此方程計算得出PFTP 的糖醛酸平均含量為30.02%，表明PFTP 為一種酸性雜多糖，這與紅外光譜的檢測結果相一致。

3 結論

本研究依照單因素試驗結論，選用響應面法改進了超聲波輔助提取法制備酸角果肉多糖的參數，結果表明50 ℃下，200 W 超聲提取40 min，液料比為30∶1（mL/g），此時得率為 31.94%，高于熱水浸提法，證明超聲波輔助提取法提取PFTP 是一種高效、節能的提取方式。通過紫外光譜檢測得出PFTP 中含有少量的蛋白質，無核酸；通過紅外光譜檢測表明PFTP 含有羧基、β-糖苷鍵結構，可能是一種酸性多糖；對比熱水浸提法所得酸角果肉多糖與PFTP，除得率不同外，紫外吸收光譜圖大致相同，紅外光譜顯示熱水浸提法可能對酸角果肉多糖的酯基及羧基破壞較多，可能會對多糖的酯化度產生影響；高效陰離子色譜法測得PFTP 主要由阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、鼠李糖（Rha）、巖藻糖（Fru）、木糖（Xyl）、葡萄糖（Gal）和半乳糖醛酸（GalA）組成，相應的摩爾比為45.56∶15.67∶6.41∶1∶5.14∶14.27∶1.95；多糖的分子量測定結果顯示PFTP 的分子量為8.262×105g/mol，且分布均一；通過間羥聯苯法測得其半乳糖醛酸的真實含量為30.02%，這一結果與紅外光譜所測PFTP 可能是一種酸性多糖吻合。