嫁接對橡膠樹砧木甲基化水平的影響

毛常麗，張鳳良，李小琴，楊 湉，倪書邦，吳 裕

（云南省熱帶作物科學研究所，景洪666100）

表觀遺傳學（epigenetics）是研究表觀遺傳變異的遺傳學分支學科，表觀遺傳變異（epigenetic variation）是指在基因的DNA序列沒有發生改變的情況下，基因功能發生了可遺傳的變化，并最終導致表型的變化，其主要涉及DNA與染色體上的一些可逆修飾以及一些轉錄調控機制。DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA調控是表觀遺傳學研究的主要方向，并在植物生長發育、逆境脅迫或環境適應過程中發揮著重要的作用［1-3］。其中，DNA甲基化是基因組DNA的一種最重要的表觀遺傳修飾方式，MSAP技術是在AFLP技術上建立起來的［4］，已被廣泛用于檢測植物在高溫［5-9］、低溫［10-12］、干旱［13-15］等非生物脅迫條件下 DNA甲基化水平變化的研究。

橡膠作為重要的物資，是國民、國防不可或缺的資源，天然橡膠是橡膠工業發展的基礎，其來源主要是巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）。天然橡膠種植材料為橡膠樹芽接苗，橡膠樹的生長、產量與砧木和接穗以及栽種的立地環境息息相關。關于砧木與接穗間的相互影響，已經在黃瓜［16］、葡萄［17］、阿月渾子［18］以及番茄［19］等作物上有過研究。在橡膠樹上，砧木與接穗間的研究包括蛋白質組學［20］、徑向生長差異［21］、生化［22］、內源激素［23］等。在表觀遺傳學方面，黃關青等構建了橡膠樹的DNA甲基化過濾文庫［24］；李海林等對橡膠樹全基因組水平DNA甲基化位點進行檢測，確定巴西橡膠樹基因組DNA甲基化模式和水平［25］；吳春太等建立了橡膠樹的MSAP反應體系，并分析了無性系DNA的甲基化水平［26］。對于橡膠樹砧木與接穗間的甲基化水平如何，至今未見報道。

本研究利用MSAP技術對巴西橡膠樹砧木與接穗間的全基因組DNA甲基化水平進行了分析，為巴西橡膠樹高產育種提供分子輔助手段及理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗設計說明

從橡膠樹無性系IAN873、GT1和RRIM600的開放授粉子代中各選1株作為采穗原株（分別記為 SI、SG、SR）；同時以這 3 個無性系的半同胞家系為砧木（分別記為RI、RG、RR）。砧木長到地徑約1.5 cm時，在離地30～40 cm高度鋸干，從抽生的新芽中選擇方向相對的兩枝留下，其余抹除。待留下的兩枝長到可嫁接粗度后開始嫁接工作。

圖1 橡膠樹自接和對接

實驗設計為3個采穗原株與3個家系建立9個砧穗組合（3×3），即得到9株砧木的雙叉植株（圖1）。為了減少嫁接過程本身造成的差異，從砧木本株采一芽片嫁接，稱為“自接”（圖1中，A）；按實驗設計建立的砧穗組合稱為“對接”（圖1中，B）。

1.2 材料

砧木采樣：在嫁接前，采集砧木 RI、RG、RR的變色期葉片，硅膠干燥保存。自接和對接采樣：嫁接完成后第二年全部鋸干，待自接和對接的芽片都抽生枝條且正常生長到2蓬葉以上，采集其變色期葉片，硅膠干燥保存。即包括9株砧木嫁接前的葉樣、嫁接后自接葉樣和對接葉樣，共27個樣品。

1.3 方法

MSAP實驗委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。采用EcoRⅠ/MspⅠ和EcoRⅠ/HpaⅡ進行酶切，用3730XL測序分析儀（美國ABI公司）對MSAP選擇性擴增PCR產物進行電泳分離擴增片段，得到的峰圖用Genemapper 4.0軟件進行分析。實驗用到的接頭及引物相關信息見表1。

表1 M S A P分析所用的接頭及引物信息

2 結果和分析

2.1 橡膠樹砧木嫁接后的甲基化模式

對EcoRⅠ/MspⅠ和EcoRⅠ/HpaⅡ酶切產物經過連接、2輪擴增后，用3730XL測序分析儀進行檢測，得到MSAP峰圖（圖2、圖3）。將得到的峰圖進行轉換，得到0/1數據（“0”表示擴增后無帶，“1”表示擴增后有帶）。經統計，橡膠樹嫁接后出現以下3種甲基化模式：當E+M有帶，E+H無帶時，表明CCGG位點發生雙鏈DNA內甲基化，即全甲基化位點；當E+M無帶，E+H有帶時，表明CCGG位點發生單鏈DNA外甲基化，即半甲基化位點；當E+M和E+H都有帶時，表明CCGG位點未發生甲基化，即非甲基化位點。

圖2 I A N 8 7 3砧木用引物組合E+M擴增所得峰圖

圖3 I A N 8 7 3砧木用引物組合E+H擴增所得峰圖

2.2 橡膠樹砧木嫁接后的甲基化水平

針對橡膠樹砧木與接穗基因組DNA的甲基化，共選出8對引物進行擴增。根據轉換得到的0/1數據，8對引物共擴增得到13 922條帶，其中甲基化位點6 862個（表2），甲基化率為49．29%，甲基化位點中全甲基化位點2 859個（41.66%），半甲基化位點4 003個（58.34%）。

表2 橡膠樹砧木甲基化位點

對3種砧木嫁接前后甲基化模式之間的轉換進行統計，結果見表3。

表3 橡膠樹嫁接前后的甲基化模式轉換

表4 橡膠樹砧木嫁接前后甲基化位點變化

統計以上數據，3種接穗嫁接于3種砧木后，以半甲基化與無甲基化間的相互轉換為主，而由半甲基化轉化為全甲基化或者由全甲基化轉化為半甲基化的很少，全甲基化與無甲基化間的轉換居中。

根據以上數據，3種接穗嫁接于3種砧木后，對IAN873砧木（RI）的甲基化位點數的影響為SI＞SG和SR；對GT1砧木的甲基化位點數的影響為SI/SG＞SR；對IAN873砧木的甲基化位點數的影響為 SI＞SG∕SR。

3種砧木嫁接前后甲基化變化情況見表4。從表4中的數據可以看出，IAN873砧木嫁接IAN873接穗后，甲基化位點數增加了16個，嫁接GT1接穗后，甲基化位點減少了17個，而RRIM600嫁接到IAN873后引起的甲基化位點數變化不大；當以GT1為砧木時，引起甲基化位點變化較大的接穗是IAN873及GT1，而RRIM600變化不大；當以RRIM600為砧木，接穗IAN873使嫁接后的甲基化位點數下降，而嫁接GT及RRIM600后甲基化位點增加，且RRIM600接穗引起位點數增加的幅度大于GT1接穗。

3 討論

在植物中，DNA甲基化主要參與植物基因表達的調控，進而調節植物的生長發育［27］，其主要通過基因的甲基化和去甲基化來調控基因的表達。本研究探討了橡膠樹砧木嫁接后的甲基化水平變化，結果表明：嫁接后砧木的甲基化水平發生了變化，且同一砧木嫁接不同的接穗引起的甲基化變化有差異；嫁接使砧木的甲基化模式發生改變，主要以半甲基化與無甲基化間的相互轉換為主。

橡膠樹種植材料為嫁接的優良無性系，橡膠樹的生長、產量等性狀取決于接穗品種、栽培的立地環境以及砧木所能提供給樹體的養分情況等，砧木品種的選擇對橡膠樹嫁接及性狀表現至關重要。本研究發現，嫁接可以改變砧木的甲基化水平及模式。Avramidou等［28］也發現，嫁接可以引起接穗甲基化水平的改變，使接穗的甲基化水平上升。李海林等［25］對巴西橡膠樹DNA甲基化的位點進行分離測序，得到橡膠樹基因組中包括轉錄因子、蛋白激酶等在內的多種類型的DNA序列中均存在甲基化現象。因此，橡膠樹嫁接后，可能在砧木與接穗間有相關的基因被甲基化或者去甲基化表達，且在砧木與接穗間相互轉移，從而導致嫁接對砧木及接穗的影響。而嫁接后砧木與接穗間甲基化及相關物質間轉移的調控機制還需作進一步的實驗進行驗證。