橡膠樹炭疽病病原菌Colletotrichum laticiphilum生物學特性研究及防治藥劑篩選

施玉萍，劉一賢，李嵐嵐，戴利銘，蔡志英

（云南省熱帶作物科學研究所，云南景洪666100）

炭疽病是危害我國橡膠樹的一種重要葉部病害，在橡膠生產上的危害僅次于橡膠樹白粉病，導致該病發生的病原菌主要為膠孢炭疽菌復合群（Colletotrichum gloeosporioidescomplex）和尖孢炭疽菌復合群（Colletotrichum acutatumcomplex）［1-2］。橡膠樹炭疽病于1906年在斯里蘭卡被首次發現，目前該病已廣泛分布于非洲中部、南美洲、亞洲南部和東南部等植膠國家［3］。在我國該病害早期只在苗圃和新植幼樹上少量發現，1962年在海南大豐農場開割膠樹上首次發現個別品系整年因病落葉，不能割膠，此后在廣東的紅五月農場及廣東徐聞、?？祪煽h各農場引起不同程度落葉。1992年橡膠炭疽病在暢好農場發生大面積流行，發病面積1 550.53 hm2，占開割面積75%，受害割株31.2萬株，造成四、五級落葉20多萬株，部分林段的膠樹因落葉多、枝條枯死，開割時間推遲一個半月，也有部分林段因多次受到炭疽病病菌的反復侵染為害，推遲2～3個月開割，干膠損失達250 t。近年來，由于大量更新和推廣高產品系，該病發生日趨嚴重，1996年僅海南墾區發病面積就達73萬hm2，損失干膠15 000 t。廣西、云南和福建等各植膠區也陸續報道其發生危害情況［4-6］。2004年，橡膠樹老葉炭疽病在云南西雙版納、紅河、普洱、臨滄、德宏和文山等植膠區不同程度發生。據勐養橡膠分公司調查，2004年8-10月，0.2 hm2橡膠林發生橡膠老葉炭疽病，病重林地的病情指數達3～4級，部分病葉脫落，致使膠乳產量急速下降［7］。

近年來，隨著分子系統學方法引入炭疽菌屬的分類研究，陸續有一些橡膠樹上的新發現病害在國內報道發生，包括C.ledongense、C.australisinense、C.bannanense和C.laticiphilum等［8-9］。由橡膠樹炭疽菌C.laticiphilum引起的橡膠樹葉部病害是我國新發現為害橡膠葉的一種病原菌，2016年在普洱市孟連增殖苗圃分離獲得。該病原菌的培養形態、孢子大小及形態、附著孢大小及形態方面等都與傳統的尖孢炭疽菌存在很大的差異，經進一步鑒定，屬于尖孢炭疽菌復合群，目前國內尚無相關研究報道，對病原菌生物學特性的研究還處于空白。本文對橡膠炭疽菌C.laticiphilum生物學特性進行了系統研究，為該病害進一步深入研究及防治提供理論基礎。

長期以來，化學農藥在控制病害過程中發揮了巨大作用，但隨著病菌的抗性產生，藥效降低，生產上對高效低毒藥劑的需求日益迫切。雖然生物防治是抑制病害的一個重要途徑，但實際應用較少，在目前尚無優良抗病品種的情況下，化學防治仍是控制病害流行的主要措施。為此，本研究采用菌絲生長速率法測定了4種常用農藥對C.laticiphilum的毒力，以期為該病害的防治提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

菌株來源：橡膠葉病菌（C.laticiphilum）采自云南省普洱市孟連農場增殖苗圃，由本項目組分離、鑒定并保存。

供試培養基：PDA培養基（馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 18 g，水 1 000 mL)；Czapek 培養基（NaNO33 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO47H2O 0.5 g，FeSO40.01 g，蔗糖20 g）；OA（燕麥片瓊脂）培養基（燕麥片 50 g，瓊脂 20 g，水 1 000 mL）；CA（胡蘿卜瓊脂）培養基（胡蘿卜200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL）；CMV（玉米粉瓊脂）培養基（玉米粉40 g，葡萄糖 20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL）。

供試藥劑：百菌清可濕性粉劑（有效成分含量75%，蘇州先正達作物保護有限公司）；代森猛鋅可濕性粉劑（有效成分含量80%，北京燕化永樂生物科技股份有限公司）；咪鮮胺水乳劑（有效成分含量450 g/L，江蘇輝豐農化股份有限公司）；丙環唑乳油（有效成分含量250 g/L，蘇州先正達作物保護有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同培養基對菌絲生長的影響

將病原菌菌株接種到PDA平板上進行活化，培養5 d后用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，分別接種到PDA、CA、CMA、OA培養基上，每個處理重復3次，培養7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.2 溫度對菌絲生長的影響

病原菌菌株活化后，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種到PDA培養基上，分別置于5、10、15、20、22、24、26、28、30、35℃共10個溫度處理下黑暗培養，每個處理重復3次，培養7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.3 pH對菌絲生長的影響

將冷卻至60℃左右的PDA培養基用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液分別調整pH值為 3、4、5、6、7、8、9、10、11并制成 PDA 平板，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種到不同pH值的平板上，每個處理重復3次，培養7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.4 不同碳源對菌絲生長的影響

以葡萄糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、果糖、木糖、可溶性淀粉、山梨醇、甘露醇、甘油等11種作為碳源，代替Czapek培養基中的蔗糖，配制不同碳源培養基，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種到不同碳源的培養基平板上，每個處理重復3次，培養7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.5 不同氮源對菌絲生長的影響

以色氨酸、胱氨酸、L-丙氨酸、酪氨酸、L-精氨酸、甘氨酸、酵母浸膏、牛肉浸膏、蛋白胨、硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀等13種作為氮源，代替Czapek培養基中的硝酸鈉，配制不同碳源培養基，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種到不同碳源的培養基平板上，每個處理重復3次，培養7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.6 光照對病原菌生長的影響

設置24 h黑暗、24 h光照（日光燈15 W）、12 h黑暗/12 h光照（日光燈15 W）3種光照條件。將病原菌接種到PDA培養基上，分別置于3種光照條件下培養7 d，每個處理重復3次，觀察菌落生長情況。

1.2.7 病原菌菌絲的致死溫度

將病原菌菌株接種到PDA平板上進行活化，培養5 d后在菌落表面滴加2 mL無菌水，用無菌棉棒將菌落表面菌絲磨碎，取菌液置于已滅菌的玻璃試管中，在 45、46、47、48、49、50、52℃恒溫水浴鍋中處理10 min，分別取0.2 mL不同溫度處理的菌液涂板于PDA平板培養基上，以一支在室溫中放置的試管作為對照，每個處理重復3次，在28℃培養箱中培養5 d后觀察菌落生長情況。

1.2.8 病原菌孢子的致死溫度

將病原菌菌株接種到PDA平板上，培養5 d后制備孢子懸浮液，10～15個孢子/視野（10×10倍），取孢子懸浮液置于已滅菌的玻璃試管中，在45、48、50、51、52、54、56、58、60℃恒溫水浴鍋中處理10 min，分別取0.5 mL不同溫度處理的孢子液涂板于PDA平板培養基上，以一支在室溫中放置的試管作為對照，每個處理重復3次，在28℃培養箱中培養5 d后觀察菌落生長情況。

1.2.9 病原菌防治藥劑的篩選

用直徑5 mm的打孔器在病原菌菌落邊緣打取菌餅，接種到含不同濃度殺菌劑的PDA培養基上，每個處理3次重復，以不含殺菌劑的PDA為對照，28℃培養7 d，用十字交叉法測量菌落直徑。以藥劑濃度對數值為橫軸（x），菌落生長抑制率的機率值（y）為縱軸制作毒力曲線，求出毒力回歸方程：y=ax+b，并計算不同藥劑對病原菌的有效抑制中濃度（EC50）。

菌落生長抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-5 mm）×100

1.2.10 數據統計

采用SPSS Statistics 24、Origin 8.5數據分析軟件。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對病原菌菌絲生長的影響

病原菌在PDA、CA、OA、CMA四種培養基上均能正常生長，PDA培養基上生長最快，7 d后菌落生長直徑達71.63 mm，PDA、CA培養基上氣生菌絲茂盛，而CMA培養基氣生菌絲稀?。▓D1）。

2.2 溫度對菌絲生長的影響

由圖2可看出，橡膠樹炭疽病病原菌在10～35℃都能生長，5℃不能生長。適宜溫度范圍為22～30℃ ，培 養 7 d 后 菌 落 直 徑 在 59.84～72.72 mm，最適溫度為26℃，培養7 d后菌落直徑達到72.72 mm，病原菌菌絲在超過30℃時對溫度比較敏感。

2.3 pH對菌絲生長的影響

病原菌菌絲在pH 3～11范圍內均能生長，在pH 5～7均有較好長勢，最適生長pH值為6，培養7 d后菌落直徑達73.11 mm。病原菌對酸堿的適應范圍比較廣，但更適宜在酸性環境下生長（圖3）。

圖1 不同培養基對菌絲生長的影響及不同培養基上的菌落形態

圖2 溫度對菌絲生長的影響

圖3 p H對菌絲生長的影響

圖4 不同碳源對菌絲生長的影響

2.4 不同碳源對菌絲生長的影響

對11種不同碳源進行比較之后發現，病原菌對可溶性淀粉利用最好，菌絲生長較快，培養7 d后菌落直徑達到62.07 mm，其次是山梨醇，菌落直徑為55.22 mm，含有乳糖、半乳糖的培養基上的病原菌長勢較慢，菌落直徑分別為39.63 mm和32.19 mm（圖4）。

2.5 不同氮源對菌絲生長的影響

由圖5可知，在含有13種不同氮源培養基上，病原菌在含牛肉浸膏的培養基上長勢最快，對氮源的利用率最高，培養7 d后菌落直徑達到70.65 mm。硫酸銨和氯化銨對病原菌有明顯的抑制作用，菌落直徑分別為16.65 mm和19.45 mm。說明病原菌對有機氮源和無機氮源都能利用，有機氮源更有利于病原菌菌絲的生長。

圖5 不同氮源對菌絲生長的影響

2.6 光照對病原菌生長的影響

觀測結果表明（表1），24 h光照條件更有利于菌絲生長，并且在光照條件下有利于產生色素。光暗交替的條件更有利于孢子產生，黑暗條件不利于菌絲生長。

表1 光照對病原菌菌絲生長的影響

2.7 病原菌菌絲的致死溫度

實驗設置了7個溫度對病原菌菌絲進行處理（表2），在溫度45～49℃條件下菌絲均能形成新菌落，在50℃條件下不能形成新菌落，說明病原菌菌絲的致死溫度為50℃，10 min。

表2 病原菌菌絲致死溫度

2.8 病原菌分生孢子的致死溫度

實驗設置了7個溫度對病原菌分生孢子懸浮液進行處理（表3），在45～49℃處理下分生孢子均能萌發形成新菌落，在50℃處理下不能形成新菌落，說明病原菌分生孢子的致死溫度為50℃，10 min。

2.9 病原菌防治藥劑的篩選

室內毒力測定結果（表4）表明，4種殺菌劑對病原菌的毒力存在明顯差異，其中咪鮮胺和丙環唑的毒力最強，EC50分別為0.1286和0.5208 mg/L。供試藥劑毒力回歸方程相關系數均大于0.9，說明藥劑不同濃度間抑菌率相關性較高，推算出的EC50較準確。

表3 病原菌分生孢子致死溫度

表4 不同殺菌劑對橡膠樹炭疽菌的室內毒力測定

3 討論

迄今為止，橡膠樹炭疽病C.laticiphilum只在哥倫比亞和印度有報道發生，但都沒有其生物學性狀及化學防治的相關研究報道。我們在病害調查過程中首次發現在我國膠園中存在該病害，且該病害的發病率高達86%，嚴重影響橡膠樹的正常生長。經對該病害的生長性狀及防治藥劑進行研究，C.laticiphilum在10～35℃都能生長，最適生長溫度為26℃。該病原菌對酸堿的適應范圍比較廣，菌絲在pH 3～11范圍內均能生長，最適生長pH值為6。菌絲在50℃條件下處理10 min停止生長，分生孢子在50℃條件下處理10 min停止萌發；通過對11種不同碳源進行比較之后發現，病原菌對可溶性淀粉利用最好，其次為山梨醇，對13種氮源比較后發現，病原菌在含牛肉浸膏的培養基上長勢最快，對氮源的利用率最高。病原菌在完全光照條件下生長最好，該結果與前人研究橡膠樹炭疽菌的最適生長溫度、最適酸堿度、碳氮源利用等方面都有所差異［10-15］。經研究發現，該病原菌菌絲生長及分生孢子萌發對自然環境的適應范圍與我國植膠區的環境條件較為一致，是典型的熱帶地區病原菌。病原菌在我國植膠區如遇合適的氣候因素很可能會引發病害的大流行，威脅我國天然橡膠產業。因此，有必要對該病害對殺菌劑的敏感性進行研究，以便應對這種潛在威脅。

咪鮮胺和丙環唑是一種廣譜殺菌劑，對由子囊菌、擔子菌和半知菌引起的病害具有明顯的防效，而百菌清和代森猛鋅是廣譜、非內吸保護性殺菌劑，廣泛用于果樹、蔬菜以及大田作物，可防治多種重要的葉部真菌病害，本研究選用了這4種殺菌劑進行室內毒力測定。結果表明，咪鮮胺、丙環唑、百菌清、代森猛鋅對病原菌的毒力存在明顯差異，咪鮮胺和丙環唑的毒力最強，而百菌清和代森猛鋅毒力較弱，該結果與陳怡志［16］、曹學仁［17］等對炭疽菌防治藥劑研究結果一致，而與王蘭英［18］、崔昌華［19］、胡曉穎［20］等的又有所差異。因而對該病菌的防治藥劑篩選也變得尤為重要，只有篩選出有效藥劑才能在實際生產中指導該病害的防治，起到高效防治病害的作用，同時也避免殺菌劑的濫用。近年來，國內外利用微生物制劑、植物源制劑及誘抗劑等對鏈格孢屬真菌引起的植物病害進行生物防治，取得了一定的效果。例如日本研發的多氧霉素和我國研發的多抗霉素對煙草赤星病、蘋果斑點落葉病具有顯著的效果，張月鳳［21］等研究發現生防放線菌CY-14發酵液對香蕉炭疽病具有顯著的防治效果。谷春艷［22-23］等研究發現解淀粉芽孢桿菌與化學藥劑復配能對草莓炭疽病及灰霉病的防治有增效作用。因此，對于橡膠樹葉部病害的防治，在采取傳統化學藥劑防治的同時，我們也應考慮結合其生物學特點，積極研發有效的微生物制劑、農用抗生素、微生物與化學藥劑復配劑等新型農藥。