滇黃精組培褐化影響因素研究

蘇 娟，張萬巧，王 曉，李昆華，韓 鄲，楊 丹，岳 健

(云南山里紅生物科技有限公司，云南 昆明 650200)

滇黃精Polygonatum kingianum為百合科Liliaceae 黃精屬Polygonatum的多年生宿根性草本藥用植物[1—3]，主要分布于廣西、四川、貴州、云南等地區。始載于《名醫別錄》，其根狀莖性平、味甘，具補氣養陰、健脾、潤肺、益腎等功效，用于陰虛肺燥，陰血不足和脾胃虛弱之癥[4]。

滇黃精目前主要來源野生采挖，資源存量大幅減少，但需求持續旺盛，供求不平衡持續加劇。因此，利用植物組織培養技術加快人工繁殖速度，對其資源保護及產業化開發具有重要意義。前人對滇黃精的組織培養研究較多[5—7]，但有關褐化現象的研究較少[8]。本研究分析滇黃精組培的褐化問題，并對其褐化控制措施進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

滇黃精帶芽塊莖采自云南山里紅生物科技有限公司種質資源基地(瀘西)。于當年3 月至4 月，從塊莖上切取新萌芽作為外植體材料。

1.2 方法

1.2.1外植體滇黃精根莖洗凈，裁成1.2 cm×1.2 cm 帶新萌芽小塊，置于洗潔精水溶液中浸泡15 min，用流水沖洗1 h，再用洗潔精搖晃清洗5 min，在超凈臺上消毒，用無菌水充分清洗，無菌濾紙吸干。經不同消毒方式滅菌后，用無菌水清洗5 次，將植物組織暴露在消毒液中的部分切除后外植體大小約為1 cm×1 cm，接種至培養基，每瓶接種外植體1 個，每處理10 瓶，重復3 次。

1.2.2不同消毒時間處理先用75%乙醇進行表面消毒30 s，再用0.1%氯化汞，2%次氯酸鈉兩種消毒劑處理，各設置5 個時間處理，即6 min、8 min、10 min、12 min、14 min。

1.2.3不同消毒方式處理設三種消毒方式：均用75%乙醇進行表面消毒30 s，再用0.1%氯化汞處理10 min；2%次氯酸鈉處理12 min；0.1%氯化汞處理8 min＋2%次氯酸鈉處理12 min。

1.2.4基本培養基及培養條件分三種基本培養基進行設計，分別為MS、1/2MS、1/4MS。培養基均添加6-BA 2.0 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1、蔗糖30 g·L-1、活性炭0.1 mg·L-1、瓊脂6 g·L-1，pH=5.8。培養條件光照1500 lx，光照周期12 h·d-1，溫度(24±2) ℃，在常規組培室進行，培養30 d 后觀察外植體褐化情況，并計算褐化率和獲得率。褐化率為褐化株數占接種總數百分比，獲得率為未污染未褐化株數占接種總數百分比。數據處理采用SPSS 18.0 進行單因素方差分析[9]。

1.2.5不同溫度處理設20、25、30 ℃三種溫度，在智能人工氣候培養箱中進行。

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對外植體褐化的影響

2.1.1氯化汞滅菌對外植體褐化的影響滇黃精外植體經過75%乙醇處理30 s 表面消毒后，再用0.1%氯化汞進行不同時間處理，統計褐化率和獲得率如表1。隨著消毒時間增加，褐化率呈遞減趨勢，獲得率呈先增后減趨勢，消毒處理10 min 的獲得率最高。綜合來看，0.1%氯化汞處理10 min 消毒效果最好。

2.1.2次氯酸鈉滅菌對外植體褐化的影響滇黃精外植體經過75%乙醇處理30 s 表面消毒后，再用2%次氯酸鈉進行不同時間處理，統計褐化率和獲得率如表2。隨著消毒時間的增加，褐化率呈先減后增趨勢，獲得率呈先增后減趨勢，處理12 min 獲得率最高。綜合來看，2%次氯酸鈉處理12 min 效果最好。

2.2 不同滅菌方式對外植體褐化的影響

試驗均用75%乙醇表面消毒30 s，然后以氯化汞和次氯酸鈉進行深度滅菌，培養7 d 后不同滅菌方式處理的褐化率和獲得率見表3。通過2%次氯酸鈉12 min+0.1%氯化汞10 min 消毒外植體的抗褐化效果最好，獲得率最高。

表1 氯化汞滅菌對外植體材料褐化的影響Table 1 Effect of mercuric chloride sterilization on browning of explants

表2 次氯酸鈉滅菌對外植體材料褐化的影響Table 2 Effect of sodium hypochlorite sterilization on browning of explants

表3 不同消毒方式對外植體材料褐化的影響Table 3 Effects of different disinfection methods on browning of explants

2.3 不同基本培養基對外植體褐化的影響

將外植體根莖芽滅菌后接種至不同培養基，培養7 d 后統計褐化率和獲得率。由表4 可知，不同基本培養基褐化率與獲得率均差異顯著，其中1/4MS 褐化率最高，達43.33%，1/2MS 褐化率最低，為23.33%；就獲得率而言，1/2MS 最高，為46.11%；其次是MS，1/4MS 的最低。

2.4 不同溫度處理對外植體褐化的影響

以外植體接種后光照1500 lx，光照周期12 h·d-1，溫度(24±2) ℃下培養作為空白對照。由表5 可知，在不同溫度處理下，與對照相比，褐化率最低為20℃，為29.66%，獲得率最高為20℃，為40.03%，對照與30 ℃處理差異不顯著。由此可見，低溫環境能抑制滇黃精外植體褐化。

表4 不同基本培養基對外植體材料褐化的影響Table 4 Effects of different basic mediums on browning of explants

3 結論與討論

表5 不同溫度處理對外植體材料褐化的影響Table 5 Effect of different temperature treatment on browning of explants

在藥用植物組織培養過程中，一般通過選擇適當的外植體、消毒方法、培養基和生長調節劑，控制培養溫度和光照，培養基中添加抗氧化劑和吸附劑，加快繼代轉瓶速度等綜合手段防止褐化[10—11]。本試驗探討消毒時間、消毒方式、基本培養基及溫度對外植體褐化的影響，結果表明，隨著消毒時間增加，使用HgCl2處理10 min、NaClO 處理12 min 抗褐化效果明顯，采用75%乙醇處理30 s，NaClO 12 min+ HgCl28 min 消毒，抗褐化效果最好；采用1/2MS 為基本培養基的抗褐化效果比MS、1/4MS 基本培養基的抗褐化效果好，這與張振霞等[12]在番荔枝中的研究結果一致。邱璐等[13]在云桑組織培養中亦發現，使用1/2MS 培養基，降低無機鹽濃度，能有效減輕褐化現象，降低褐化率。在滇黃精組織培養過程中對其進行低溫處理能明顯降低褐化率，溫度越低，抗褐化效果越好，這與Huang 等[14]、趙伶俐等[15]的結論一致。

在藥用植物組織培養過程中，影響外植體褐化的因素較多，本試驗初步探索消毒方式、基本培養基及培養溫度對滇黃精根莖芽組織培養過程中褐化的控制效果，發現先經過75%乙醇處理30 s 消毒表面，再用NaClO 12 min+HgCl28 min 消毒的抗褐化效果最好；選用1/2MS 基本培養基能有效降低褐化率；低溫環境(20 ℃)能進一步減少褐化的發生。