磷脂酶D的重組表達及其在磷脂酰絲氨酸合成中的應用

侯海娟，龔勁松，翟珅，徐敏，周文斌，陳杰鵬，段麗麗，張曉梅，許正宏,2，史勁松*

1(江南大學 藥學院，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)3(廣東雙駿生物科技有限公司，廣東 汕頭,515071)

磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)于1942年由JORDI FLOCH首次從牛腦中提取出來，隨后對其進行了分子結構的定性分析[1]。它是磷脂中一種能夠調控膜蛋白功能狀態的磷脂[2]，在細胞膜的磷脂雙分子層中占有10%～20%[3]，由于能夠改善記憶力，并對抑郁癥有良好的抑制作用[4]，被稱為“腦專一性營養物質”[5-6], PS在功能食品和制藥領域有著廣闊的應用前景[7-8]。近年來,人們對PS的關注度越來越高。

PS對人體生命活動具有關鍵作用，但其在自然界中的含量較少，隨著目前人們對PS需求量日益增加，高效制備PS的方法越來越受到廣泛關注。國內外已有不少學者對PS的制備方法進行研究，目前主要有提取法和生物酶轉化法。提取法是指通過有機溶劑從植物種籽和動物細胞中萃取獲得PS，酶轉化法是指利用磷脂酶D(phospholipase D，PLD)的轉磷脂酰作用，生物催化合成PS。由于提取法獲得的PS得率較低，且具有攜帶瘋牛病等動物流行病毒的安全風險，而酶轉化法具備成本較低、操作簡單、反應工藝綠色環保等優點，逐漸成為了合成PS的理想方法[9-11]。

PLD (EC3.1.4.4)具備水解磷酸二酯鍵和堿基互換的能力[12]。存在于植物、動物和微生物中，對于細胞信號傳導、脂質代謝及生物膜形成等代謝過程具有重要作用[13-15]。在眾多細菌來源的PLD中，鏈霉菌來源的PLD在磷脂合成中具有更好的應用潛力[16]。PLD的催化反應分為2種：一種是催化底物磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine, PC)的磷酸酯鍵發生水解反應生成磷脂酸(phosphatidic acid, PA)和羥基化合物膽堿；另一種是催化羥基化合物與磷脂?；鶊F發生堿基互換反應，也就是磷脂?；D移反應[17-18]。?；D移反應可利用底物磷脂酰膽堿合成稀有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)等[19-21]。

早期對PLD的研究主要集中于野生菌培養發酵條件的優化[22-25]。但由于野生菌發酵周期長，培養條件復雜，越來越多的研究者采用異源表達的方法生產PLD[26]。ZAMBONELLI等[27]以StreptomycesPMF的全基因組為模板，擴增獲得了一段PLD序列，并將其表達在E.coliBL21(DE3)pLysE中，酶活為0.015 U/mL。本研究為實現PLD應用于生物催化制備PS，嘗試將來源于鏈霉菌的PLD基因在研究相對成熟的大腸桿菌體系中進行異源表達和表征，并探究PLD在有機相-水相雙向體系下的PS合成工藝條件，為生物法制備PS奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

克隆宿主E.coliJM109、表達宿主E.coliBL21(DE3)、載體pET-28a(+)均為本研究室保藏。

1.1.2 主要儀器與試劑

Waters 1525液相儀，美國Waters公司；大豆卵磷脂PC60(PC含量為60%)、膽堿氧化酶、過氧化物酶、磷脂酰絲氨酸(PS,99%)，美國Sigma-Aldrich公司；酵母粉、蛋白胨，Thermo Scientific公司；其他試劑均為國產分析純和化學純。

底物卵磷脂溶液：稱取88 mg PC60溶于10 mL底物緩沖液(40 mmol/L Tris-HCl pH 7.5)。

4-氨基安替比林溶液(4-ATT)：0.058 g溶于40 mL Tris-HCl (40 mmol/L，pH 7.5)。

苯酚溶液：0.247 g溶于40 mL Tris-HCl (40 mmol/L，pH 7.5)。

反應終止液：100 mmol/L EDTA溶于40 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)。

過氧化物酶溶液(12.5 U/mL)：總酶活50 U的過氧化物酶粉末溶于4 mL超純水中。

膽堿氧化酶溶液(12.5 U/mL)：總酶活50 U的膽堿氧化酶粉末溶于4 mL超純水中。

1.1.3 培養基

LB培養基：質量濃度10 g/L NaCl、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉；調節pH為7.0。滅菌條件：121 ℃，20 min。

1.2 方法

1.2.1 構建重組質粒pET-28a(+)-sspld

以實驗室前期保藏的1條具有良好磷脂酰水解活力的來源于鏈霉菌(Streptomycessp.)的磷脂酶D編碼序列為模板，設計攜帶BamHI和HindIII酶切位點的引物，sspldF (CGG GAT CCA TGG CAC GTC ATC CG)、sspldR (CCA AGC TTT TAA TCC TGA CAA AT) 擴增目的基因。擴增產物以瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，回收，與本實驗中選用的表達質粒pET-28a(+)在37℃進行雙酶切后連接，轉化E.coliJM109感受態細胞，取單菌落進行菌落PCR，提取重組質粒后進行酶切和測序驗證。

1.2.2 表達重組質粒pET-28a(+)-sspld

將重組質粒轉化E.coliBL21，轉化子接種于LB培養基培養至OD600達到0.6～0.8時,加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，25 ℃搖床培養8 h，離心收集菌體。用緩沖液洗滌重懸菌體，并進行超聲破碎，離心后獲得的上清液即為含PLD的粗酶液。

1.2.3 酶活檢測

60 ℃條件下，40 μL酶液與60 μL底物卵磷脂溶液反應20 min，加入50 μL反應終止液后于100 ℃沸水浴5 min，6 000 r/min離心5 min，吸取上清加入60 μL膽堿氧化酶、200 μL苯酚溶液、200 μL 4-氨基安替比林溶液和40 μL過氧化物酶，反應液于37 ℃反應20 min。取反應液于OD505處測定吸光值。酶活定義：每小時催化1 μmol膽堿所用酶液即為1個酶活單位(U/mL)。

1.2.4 培養條件優化

依次對初始誘導條件(25 ℃搖床培養8 h, OD600達到0.6～0.8時加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG)進行優化。設置其他條件不變，改變誘導溫度(15、20、25、30、35 ℃)；在最佳誘導溫度下設置其他條件不變，改變誘導時間(8、10、12、14、16 h)；設置IPTG濃度不變，在最優誘導溫度和誘導時間下改變加入誘導劑時的初始菌體濃度OD600(0.6、0.8、1.0、1.2、1.4)；在前面3種最優條件下，改變IPTG濃度(0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L)。

1.2.5 酶學性質

最適pH值和pH穩定性：配制不同緩沖液體系(pH 4.0～10.0, pH值間隔0.5)，替代標準PLD酶活檢測方法中所使用的pH 7.5，40 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，以酶活力最高的樣品為對照，設置值為100%；將酶液分別在不同pH值下放置60 min，進行殘余酶活的檢測，以未經任何處理的酶液作為對照。

最適溫度和溫度穩定性：在初始緩沖液體系中，取適量酶液分別測定其在不同溫度下(20～80 ℃，間隔5 ℃)的酶活力，以酶活測定最高值作為100%；將酶液分別在不同溫度下放置60 min后進行殘余酶活的測定，以未經任何處理的酶液作為對照。

金屬離子及化學試劑：將NaCl、KCl、LiCl、CoCl2、MnCl2、CaCl2、MgCl2、CuCl2、FeCl3、FeCl2、BaCl2、AgCl3、ZnSO4、Al2(SO4)3、β-巰基乙醇、DTT、SDS、PMSF、EDTA等化學試劑分別配制成10、50 mmol/L母液，在酶液中分別加入適量母液，使其終濃度分別為1、5 mmol/L。于4 ℃條件下放置60 min后，測定酶的殘留活性，并以無上述試劑加入的酶液為對照，計算酶的相對活性。

1.2.6 產物PS的檢測分析

采用HPLC檢測，色譜柱：Vensil XBP Silica(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相：V(正己烷)∶V(異丙醇)∶V(25 mmol/L乙酸銨溶液)=8∶8∶1；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；檢測器：ELSD蒸發光檢測器；漂移管溫度：65 ℃；霧化器氮氣流速：1.8 SLPM。

1.2.7 PS的制備工藝優化

初始催化體系：有機相為8 mL乙酸乙酯，PC60質量濃度為8 mg/mL；水相為8 mL粗酶液，其中包含200 mgL-絲氨酸；兩相液體混合反應12 h。PS即存在于有機相中。

工藝優化：對不同的催化條件進行優化，包括有機溶劑的種類(乙醚、正己烷、乙酸乙酯、氯仿)，底物濃度比(L-Ser∶PC，1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)，有機相和水相體積比(4∶4、4∶3、4∶2、4∶1)以及反應溫度(25、30、35、40、45、50 ℃)。PS產率定義：HPLC檢測到的PS濃度與初始投入的PC60濃度的百分比。

2 結果與分析

2.1 重組菌株的構建

通過PCR擴增獲得攜帶有酶切位點的sspld序列，電泳分析顯示目的基因大小為1 600 bp左右，如圖1-a所示。

圖1 重組質粒PCR驗證(a)，重組質粒雙酶切產物核酸電泳圖(b)和重組菌的SDS-PAGE分析(c)Fig.1 PCR amplification of the pld gene (a)， restriction endonucleases digestive identification of recombinant plasmids (b) and SDS-PAGE analysis of recombinant strains (c)注：圖1-a中，M-Marker;1-sspld;圖1-b中，M-Marker;1- sspld;圖1-c中，M-Marker;1-E. coli BL21/pET-28a(+);2-E. coli BL21/pET-28a(+)-sspld

雙酶切驗證結果如圖1-b所示，在1 600 bp左右有目的條帶存在，5 000 bp位置處條帶與表達載體pET-28a(+)大小一致。結合測序結果，表明重組質粒構建成功。將其轉化E.coliBL21，經菌液PCR、提取質粒酶切及測序驗證，獲得陽性轉化子，并接種于LB培養基發酵誘導產酶。重組菌株E.coliBL21/pET-28a(+)-sspld發酵酶液經分子量分析，結果如圖1-c所示，蛋白大小約為60 kDa，與其理論值一致。酶活檢測結果顯示以卵磷脂為底物其酶活能達到17.07 U/mL。

2.2 重組菌株誘導條件優化

誘導條件的改變對菌體的生長速度和產酶有著重要影響。由圖2可知，初始誘導溫度為20 ℃時發酵酶活最高。加入IPTG的最佳時間應為重組菌生長至OD600為1.0。當IPTG終濃度為0.5 mmol/L時，重組菌誘導發酵所產PLD的酶活可達最高。重組菌在誘導14 h時酶活達到最高，繼續增加誘導時間，酶活逐漸降低。最終，重組菌經優化后酶活最高可達38.58 U/mL，是優化前的2.26倍。

2.3 酶學性質研究

2.3.1 最適反應pH和pH穩定性

本研究首先對粗酶液的最適反應pH以及在不同pH下的酶活穩定性進行了評價。由圖3可知，PLD粗酶液的最適pH反應為7.5。在pH 4.0～7.5，相對酶活隨著pH的增加而增加，而在pH高于7.5時，相對酶活則開始下降，因此中性條件更適合重組酶反應，強酸強堿條件容易使酶變性失活，這與來源于StreptomycesPMF的PLD性質相似[27]?？疾靝H穩定性的結果表明，PLD粗酶液在pH 6.5～8.5比較穩定，殘余酶活保持在80%以上。

2.3.2 最適反應溫度和溫度穩定性

由圖4可知，PLD重組菌的最適反應溫度為60 ℃。在20～60 ℃，相對酶活隨著溫度的增加逐漸增加，而在更高溫度條件下，相對酶活開始緩慢下降，可能是因為在過高溫度下，酶蛋白的空間結構迅速被破壞，使得酶活大幅度降低[28]。磷脂酶D重組菌在55 ℃以內較穩定，在55 ℃時的殘余酶活為69%，但在高于60 ℃條件下殘余酶活則急劇下降。

2.3.3 金屬離子及化學試劑對酶活的影響

金屬離子對酶活也會產生重要影響，由表1可知，在加入蛋白抑制劑后，磷脂酶D粗酶液酶活被2-ME、DTT、SDS和PMSF部分抑制，而被EDTA幾乎完全抑制，在5 mmol/L的EDTA作用下，酶活僅為對照的6%。在加入金屬離子后，Mg2+、Na+和Mn2+在1和5 mmol/L下對酶活均沒有明顯影響；K+、Cu2+、Li+、Ba2+、Ca2+、Co2+、Fe3+、Zn2+和Al3+對酶活具有促進作用。Ca2+對酶活的促進作用最為明顯，5 mmol/L的Ca2+可使酶活提高至對照的134%。

圖2 誘導溫度(a), OD600 (b), IPTG濃度(c)和誘導時間(d)對酶活的影響Fig.2 Effect of induction temperature (a), induction opportunity (b), IPTG concentration (c) and induction time (d) on PLD activity

圖3 pH及穩定性對酶活的影響Fig.3 Effect of pH and pH stability on PLD activity and stability

圖4 溫度及穩定性對酶活的影響Fig.4 Effect of temperature and temperature stability on PLD activity and stability

表1 金屬離子及化學試劑對PLD酶活影響Table 1 Effects of met al ion and chemical reagents on PLD activity

2.4 PS的制備工藝優化

為篩選出PLD催化制備PS的最適條件，本研究對轉化條件中的有機溶劑種類、有機相與水相體積比、底物L-Ser與PC60的濃度比、轉化溫度4個因素進行了系統優化，結果如圖5所示。以乙酸乙酯為有機相時的PS轉化率最高，約為14.2%，因此將乙酸乙酯作為催化反應中的有機相。有機相與水相比例為4∶2，即有機相為8 mL，水相為4 mL時，PS的轉化率最高，因此選擇有機相與水相比例為4∶2作為反應體系中兩相體積比。隨著L-ser與PC60濃度比增加，PS轉化率逐漸增大，當比例為5∶1，即PC60質量濃度為8 mg/mL，L-ser質量濃度為40 mg/mL時，轉化率達到最高，因此選擇反應體系中底物L-ser和PC60的最適濃度比為5∶1。在此基礎上對轉化溫度進行了考察，結果顯示當反應溫度為40 ℃時，PS轉化率達到最高為28%，此時PS產量為1.34 g/L。

圖5 不同有機溶劑(a),有機相與水相體積比(b),底物濃度比(c)和溫度(d)對PS轉化率的影響Fig.5 Effect of different organic solvents (a), organic and aqueous phase volume ratio(b), substrate concentration ratio (c) and temperature (d) on PS yield

3 結論

近年來，PS廣泛應用于醫療、保健行業，主要用于治療腦衰老和修復腦損傷，且療效顯著。PLD因其較高的轉磷脂?；钚?，寬泛的反應溫度和pH值，被廣泛用于磷脂類產品的合成。目前制備PS的方法主要為PLD的生物轉化法。本研究首先實現了PLD在大腸桿菌中的異源表達，并對重組菌產酶誘導條件進行了初步優化，酶活可達38.58 U/mL。為了評估生物催化劑的應用性能，了解重組菌的催化性質和特點，并為其生物轉化應用奠定基礎，本研究進一步對重組PLD的催化性質進行了考察。最后通過對有機溶劑種類、有機相與水相體積比、底物濃度比及轉化溫度這些轉化條件的優化，以PLD為催化劑制備PS最高產量達1.34 g/L。該PLD具有良好的堿基互換能力，在催化產生稀有磷脂方面具有良好的應用前景。