褐色嗜熱裂孢菌脫色過氧化物酶的表達及發酵條件優化

朱竹兵，孫亞武，唐蕾,*

1 (工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2 (江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

染料脫色過氧化物酶(DyPs)是一類具有降解多種染料能力的酶類，首次發現于真菌ThanatephoruscucumerisDec 1中[1]，屬于胞內蛋白[2]。1999年，研究者將其分離純化，分析其特征發現，在407 nm處有1個Soret吸收峰，以及它的Na2S2O4還原形式在556 nm有1個吸收峰，表明血紅素組分的存在[3]。深入研究發現， DyPs是血紅素過氧化物酶家族中區別于傳統血紅素過氧化物酶的新型家族，例如，DyPs在二級結構上具有多個α-螺旋和β折疊，其他類型血紅素過氧化物酶缺少β折疊[4]；DyPs有特定結構Fe-His-Asp，而血紅素過氧化物酶有Fe-His-His三聯體的保守氨基酸[5-7]。

DyPs的特點是利用過氧化氫作為電子受體催化各種有機物，包括蒽醌染料[8]、酚類底物、藜蘆醇[9]、愈創木酚[10]、木質素及木質素模型化合物[11]，尤其對蒽醌類染料活性最高，因而具有潛在的應用價值，可以實現生物法對染料污水的徹底降解，從而避免化學、物理等方法降解的2次污染問題。目前，人們主要從脫色過氧化物酶的底物特異性、多樣性、晶體結構、分類、定點突變、催化機理等[5,12-15]方面展開研究，不僅提高了DyPs的穩定性和表達效率，而且實現了脫色過氧化物酶對底物的有效催化。但是在細菌中異源表達DyPs時，重組蛋白的含量偏低,一般在10 mg/L以下。最近的研究發現，TfuDyP與修飾蛋白(SUMO)[16]融合表達，大腸桿菌中重組蛋白量可增至約200 mg/L，然而高度過表達的SUMO-TfuDyP幾乎沒有活性。通過紫外-可見吸收光譜法和高分辨率質譜法對酶的分析表明大部分高度過表達的酶只包含有鐵缺乏的血紅素前體原卟啉IX(PPIX)而不是血紅素[17]。血紅素作為脫色過氧化物酶的輔基，其胞內合成量對DyPs催化活性起著至關重要的作用，如何在提高DyPs表達量的同時，提高其輔基血紅素的含量尚待深入研究。

本文以來源于褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifidafusca)的TfuDyP為研究對象。以pET28a(+)為載體，在大腸桿菌中異源表達TfuDyP。一方面通過誘導劑濃度、誘導時間、誘導溫度優化，獲得重組蛋白TfuDyP最佳表達條件。另一方面研究了外源添加劑對重組TfuDyP中血紅素飽和度影響，以期更好地提高輔基血紅素合成，從而提高目的蛋白的催化活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌株

宿主菌E.coliBL21由實驗室保藏，含有目的基因的表達質粒pET-28a(+)購于南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.1.2 培養基

LB液體培養基：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。

LB固體培養基：在LB液體培養基中加入2%瓊脂。

1.1.3 主要試劑

SuperBradford蛋白定量試劑盒,康為世紀生物科技有限公司;活性藍19,上海一基實業有限公司;菌株構建所用的質粒提取試劑盒,購自TaKaRa(大連); 5-氨基乙酰丙酸,購自梯希愛化成工業發展有限公司。

1.1.4 儀器設備

冷凍離心機,日本日立公司; SM-5600細胞超聲破碎儀,美國cole-parmer; AKTA AVANT25,美國GE公司; Enspire酶標儀,美國珀金埃爾默有限公司;紫外可見分光光計,日本日立株式會社。

1.2 方法

1.2.1 TfuDyP在大腸桿菌中的構建

利用National Center for Biotechnology Information (NCBI)數據庫獲得TfuDyP(accession number Q47KB1)全長核酸序列，合成目的基因，以已購的質粒pET-28a(+)為載體，將含有目的基因的質粒轉化到E.coliBL21進行異源表達，重組質粒如圖1所示。

圖1 重組質粒pET28a(+)-TfuDyP示意圖Fig.1 Schematic representation of recombinant plasmid pET28a(+)-TfuDyP

1.2.2 重組TfuDyP分離純化

將重組菌株接種到含有100 mg/L卡那霉素的LB培養基中，200 r/min、37 ℃培養12 h，以4%(V/V)接種量轉接至含有100 mL新鮮培養基的500 mL搖瓶中，相同條件培養至菌體OD600達到0.6～0.8時。向培養基中添加終濃度為0.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃苷(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)，30 ℃誘導12 h，8 000 r/min離心20 min得到菌體，用 50 mmol/L的pH 7.4磷酸鉀緩沖溶液重新懸浮細胞，超聲破碎30 min，10 000 r/min離心30 min收集上清液，過0.22 μm水系濾膜得到粗酶液，通過1 mL His TrapTMHP親和鎳柱分離純化，收集目的蛋白，進行SDS-PAGE電泳以鑒定重組TfuDyP純度。

1.2.3 酶活力及蛋白濃度的測定

向反應體系中依次加入100 mmol/L醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.5)，100 μmol/L活性藍19和適量的酶液，最后加入終濃度為0.1 mmol/L過氧化氫啟動反應，酶促反應10 min，然后通過加入200 μL 2% SDS終止反應。在室溫下，于波長595 nm處檢測吸光值變化[17]。蛋白質濃度測定采用BCA法，以牛血清蛋白為標準蛋白。

TfuDyP酶活定義：在25 ℃，pH 4.5條件下，每分鐘氧化1 μmol活性藍19所需的酶量為1 U。比酶活測定如式(1):

(1)

式中：比酶活單位U/mg;酶活單位U/mL;蛋白質量濃度,mg/mL。

1.2.4 重組TfuDyP的表達條件優化

表達條件優化：向培養基中添加終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L的IPTG，誘導時間為8、10、12、14、16 h，誘導溫度為16、23、30、37 ℃，8 000 r/min離心20 min得到菌體，用 50 mmol/L的pH 7.4磷酸緩沖溶液重新懸浮細胞，超聲破碎30 min，10 000 r/min離心30 min收集上清液，分離純化，測定蛋白濃度，計算比酶活。

1.2.5 外源添加物對重組TfuDyP表達的影響

1.2.5.1 氨基酸與金屬離子對重組TfuDyP表達及酶活性的影響

向培養基中分別添加終濃度為100 μmol/L的組氨酸(His)、谷氨酸(Glu)、FeCl2、CoCl2以及MnCl2；分別添加終濃度為0、40、60、80、100、120 μmol/L的FeCl2；在最佳表達條件下培養、收集菌體、破碎、離心、收集上清液過0.22 μm水系濾膜得到粗酶液，測定菌體生長量和計算酶活。

1.2.5.2 氯高鐵血紅素和5-氨基乙酰丙酸濃度對重組TfuDyP表達及酶活性的影響

向培養基中分別添加終濃度為0、12、16、20、24 μmol/L的氯高鐵血紅素；分別添加終濃度為0、100、150、200、300、400、500 μmol/L的5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)。在最佳表達條件下培養，測定菌體生長量和計算酶活。

1.2.6 外源添加物對重組TfuDyP中血紅素飽和度的影響

分別將100 μmol/L的5-ALA、氨基酸(Glu)、金屬離子(Fe2+、Mn2+、Co2+)、氨基酸與鐵組合(Glu+Fe2+)加入培養基中，最佳表達條件下培養，收集菌體離心、懸浮、破碎、離心，收集上清液過0.22 μm水系濾膜得到粗酶液，通過1 mL His TrapTMHP親和鎳柱分離純化，用10個柱體積的洗脫緩沖液進行線性洗脫，對目的蛋白進行全波長掃描和比酶活的計算。

血紅素飽和度定義為在408 nm處的吸光值與280 nm處之比，即A408/A280。

2 結果與分析

2.1 TfuDyP在大腸桿菌中的異源表達

2.1.1 TfuDyP的表達與純化

將含有全長1 293 bp的目的基因的pET28a(+)-TfuDyP和空載pET28a(+)質粒分別轉化至E.coliBL21中進行異源表達。收集菌體、破碎、離心、分離純化，將粗酶液和純化后蛋白進行SDS-PAGE電泳確定目的蛋白表達情況。結果如圖2，有明顯的目的蛋白條帶，分子質量約為46 kDa，與理論計算值一致。將目標條帶割膠回收，進行MALDI-TOF質譜分析[18]，檢測數據庫為SwissProt 201704 (554241 sequences; 198410167 residues)，與庫中理論質量為45 957 Da的dye-decolorizing peroxidase Tfu_3078 OS=Thermobifidafusca匹配，匹配分數為432(表1)，確定重組TfuDyP在E.coliBL21成功表達。

1-純化的TfuDyP；2-Marker；3-空載pET-28a；4-不加IPTG誘導劑；5-IPTG誘導表達圖2 重組蛋白TfuDyP表達SDS-PAGE電泳分析圖Fig.2 The SDS-PAGE electrophoresis for recombinant TfuDyP expression

表1 重組蛋白TfuDyP的飛行時間質譜分析Table 1 Time-of-flight mass spectrometry analysis of recombinant TfuDyP

注：DYP THEFY; MASS:45957; Score:432; Matches:6(5); Sequences:6(6) Dye-decolorizing peroxidase Tfu_3078 OS=Thermobifidafusca(strain YX) GN=Tfu_3078 PE=1 SV=1。

2.1.2 重組TfuDyP誘導條件優化

在新生肽鏈的聚集速率高于蛋白折疊速率的情況下，容易出現不可溶性蛋白。因此，如何降低重組蛋白合成的速率就顯得尤為關鍵，通常采用的方法為降低培養溫度和使用低濃度的誘導劑。低溫下重組蛋白的合成速率降低，新合成的蛋白就擁有更多的時間進行折疊。此外，降低培養溫度也可以減少重組蛋白被宿主降解的量，提升重組蛋白的穩定性[19]。因此，本實驗對影響酶表達水平的關鍵因素即誘導劑濃度、誘導時間和誘導溫度進行了研究。

結果表明，當IPTG濃度為0.3 mmol/L時，重組TfuDyP的比酶活達到最大值21.3 U/g，隨著誘導劑濃度增加，比酶活緩慢下降(圖3-a)。在誘導時間為14 h時，比酶活達到最高值24 U/g，而在低于14 h的情況下，比酶活隨著誘導時間的增加明顯升高，誘導時間高于14 h時，比酶活反而下降(圖3-b)。當誘導溫度為30 ℃時，比酶活最高值27.9 U/g，接近16 ℃時的2倍，可以看出溫度對酶活影響較大(圖3-c)。溫度較低(16 ℃)時，菌體的繁殖受阻，活性蛋白合成量低，酶活較低。溫度過高(37 ℃)，重組TfuDyP的表達水平提高，但是高溫時重組TfuDyP的合成速率高于蛋白的折疊速率，容易形成不可溶性蛋白，導致酶活降低。綜上所述最佳表達條件為IPTG濃度0.3 mmol/L，誘導時間14 h，誘導溫度30 ℃。

圖3 重組蛋白TfuDyP表達條件優化Fig.3 Optimization of expression conditions of recombinant TfuDyP

2.2 外源添加物對重組TfuDyP表達及酶活性的影響

DyPs是血紅素過氧化物酶家族中的一種，重組TfuDyP必須與輔基血紅素結合，才能實現對底物的催化活性。環境因素對重組TfuDyP表達和血紅素合成起著關鍵作用，例如，Fe2+、血紅素前體 5-ALA以及氯高鐵血紅素通常作為添加物以促進血紅素合成[20-22]；谷氨酸參與TfuDyP的組成和提供血紅素合成的前體[23]；Mn2+是代謝途徑中許多酶類的激活劑。本實驗選取幾種外源添加劑(Glu、His、Fe2+、Mn2+、Co2+、氯高鐵血紅素、5-ALA)，在上述最佳表達條件下，研究其對重組TfuDyP酶活的影響。

2.2.1 氨基酸與金屬離子對重組TfuDyP表達及酶活性的影響

向培養基中分別添加終濃度為100 μmol/L的His、Glu以及FeCl2、CoCl2、MnCl2，其中不添加任何添加劑為對照組，考察氨基酸和金屬離子對重組TfuDyP酶活和菌體生長的影響。結果如圖4-a所示，CoCl2對重組TfuDyP酶活有一定抑制作用，添加His對重組TfuDyP酶活和菌體的生長基本保持不變，外源添加FeCl2、MnCl2和Glu都能提高重組TfuDyP酶活和菌體生長量。從中可以看出FeCl2對酶活影響最明顯，因此，進一步探究了FeCl2濃度對重組TfuDyP表達及酶活性的影響。結果表明隨著FeCl2濃度增加，酶活和菌體量呈現增長趨勢，提高濃度為80 μmol/L時，酶活達到最大值31.31 U/L，較空白對照提高近67.6%(圖4-b)。然而當Fe2+濃度高于60 μmol/L，菌體量逐漸下降。

圖4 金屬離子和氨基酸對重組TfuDyP酶活和菌體生長影響Fig.4 Effect of metal ions and amino acids on recombinant TfuDyP activity and cell growth

2.2.2 氯高鐵血紅素和5-ALA濃度對重組TfuDyP表達及酶活性的影響

實驗結果顯示，當氯高鐵血紅素濃度達到16 μmol/L和18 μmol/L時，重組TfuDyP酶活和菌體濕重分別達到最大值44.95 U/L和6.05 g/L，低濃度的氯高鐵血紅素對重組TfuDyP酶活和菌體量具有明顯的促進作用。當氯高鐵血紅素濃度大于18 μmol/L時，對菌體生長有明顯的抑制作用(圖5-a)。

圖5-b為5-ALA濃度對重組TfuDyP酶活和菌體生長的影響。當外源添加的5-ALA濃度低于400 μmol/L時，酶活與其添加量呈現出高度線性正相關，當濃度為400 μmol/L酶活達到最大值65 U/L，大約是對照組的3倍。當5-ALA濃度達低于200 μmol/L時，菌體量與5-ALA濃度呈線性增長。

本實驗在最佳表達條件下，研究了添加劑種類和濃度對重組TfuDyP表達及酶活性的影響。適量濃度的Glu、Fe2+、Mn2+、氯高鐵血紅素和5-ALA，一方面提高了菌體生長量，另一方面促進了重組TfuDyP催化活性。而鈷離子抑制了重組TfuDyP酶活。實驗結果表明，添加劑對重組TfuDyP酶活性影響存在差異：5-ALA>氯高鐵血紅素> Fe2+> Glu > Mn2+>對照組> Co2+。

圖5 氯高鐵血紅素和5-ALA對重組TfuDyP酶活和菌體生長影響Fig.5 Effect of hemin and 5-ALA on recombinant TfuDyP activity and cell growth

2.3 外源添加物對重組TfuDyP中血紅素飽和度和酶活性的影響

從2.2研究結果中可以看出，5-ALA等外源添加劑對重組TfuDyP催化活性產生一定影響，為了探究外源添加劑對重組TfuDyP酶活的影響與血紅素的關系，向培養基中分別添加終濃度為100 μmol/L的5-ALA、Glu、Fe2+、Mn2+、Co2+、Fe2++ Glu，其中不添加任何添加劑為對照組，在最佳表達條件下誘導表達，對純化目的蛋白進行全波長掃描。

2.3.1 外源添加劑對重組TfuDyP中血紅素飽和度的影響

波長408 nm為血紅素的特征吸收，全波長掃描顯示添加了5-ALA、Fe2+、Glu、Mn2+、Co2+的408 nm處的吸收值分別為1.378、0.89、0.741、0.579、0.51(圖6)。結果表明，除了Co2+，添加劑(5-ALA、Fe2+、Glu、Mn2+)明顯高于對照組。

添加Glu + Fe2+、Fe2+、Glu和對照組在波長408 nm處的吸收值分別為1.027、0.89、0.741、0.579(圖7)，表明氨基酸與Fe2+的組合可進一步提高重組TfuDyP中血紅素的含量。

圖6 添加劑對重組TfuDyP中血紅素飽和度的影響Fig.6 Effect of different amino acids on heme saturation in recombinant TfuDyP

綜上所述，重組TfuDyP在波長408 nm處的吸收值：5-ALA>Fe2+>Glu>Mn2+>對照組>Co2+，與添加劑對重組TfuDyP酶活的影響結果是一致的。氨基酸與Fe2+的組合能夠進一步促進血紅素合成，但遠不及5-ALA的添加，氨基酸與Fe2+的添加不是簡單的疊加效應，對血紅素合成可能是復雜的協同作用。

2.3.2 重組TfuDyP中血紅素飽和度和酶活的關系

為了探究重組TfuDyP酶活和血紅素飽和度兩者之間的關系，將各種添加劑以終濃度為100 μmol/L添加到培養基中，在最佳表達條件下誘導表達，對純化的目的蛋白進行全波長掃描和比酶活的計算。

圖7 鐵離子和氨基酸對重組TfuDyP中的血紅素飽和度的影響Fig.7 Effect of iron ions and amino acids on heme saturation in recombinant TfuDyP

實驗結果表明，Glu、5-ALA、Fe2+、Glu +Fe2+能夠提高重組TfuDyP中血紅素飽和度，Co2+對Heme飽和度具有抑制作用(表2)。選取幾種外源添加劑(Co2+、Glu+Fe2+、5-ALA)，考察重組TfuDyP中血紅素飽和度與比酶活關系。實驗結果顯示，添加劑對重組TfuDyP中血紅素飽和度的影響和比酶活的影響呈正相關性(圖8)。

表2 不同外源添加劑對重組TfuDyP中Heme飽和度的影響Table 2 Effect of different exogenous additives on heme saturation in recombinant TfuDyP

注：B-不加任何添加劑的對照組；其他外源添加劑最終濃度0.1 mmol/L。

圖8 添加劑對酶活與heme飽和度影響關系圖Fig.8 Effect of different additives on enzyme activity and heme saturation

血紅素輔基摻入脫輔基重組蛋白被認為對于全蛋白的可溶性和活性至關重要，提高血紅素及其前體物質5-ALA的水平是目前使用的最主要策略[24]，KERY等[25]發現5-ALA的添加提高了在大腸桿菌中表達的人源胱硫醚β-合成酶的血紅素飽和度和產率，與本文一致；但是也有報道指出，5-ALA的添加對目標重組血紅素過氧化物酶的活性沒有顯著影響[19,28]，與本研究的結果不同。而Co2+、Glu+Fe2+對血紅素飽和度及TfuDyP的比酶活關系的影響未見報道。

3 結論

脫色過氧化物酶是血紅素過氧化物酶家族中的新家族，以血紅素為輔基，過氧化氫為電子受體，催化各種有機物。本課題以來源于T.fusca的DyP型過氧化物酶(TfuDyP)為研究對象，以pET28a(+)為載體，在大腸桿菌中異源表達脫色過氧化物酶TfuDyP，一方面優化重組TfuDyP表達條件(誘導劑濃度、誘導時間和誘導溫度)，另一方面研究了添加劑對重組TfuDyP酶活和血紅素飽和度影響，得出如下結論：

誘導劑濃度為0.3 mmol/L，誘導時間為14 h，誘導溫度30 ℃，胞內比酶活達到27.9 U/g，是重組蛋白TfuDyP最佳表達條件。優化培養基成分，發現氯高鐵血紅素、5-ALA、Glu、Fe2+、Mn2+能提高重組TfuDyP催化活性，尤其是氯高鐵血紅素、5-ALA、Fe2+。在研究外源添加劑對血紅素飽和度影響過程中發現，在血紅素最大吸收波長408 nm處的吸收值：5-ALA>Glu + Fe2+>Fe2+>Glu>Mn2+>對照組>Co2+，與添加劑(5-ALA、氯高鐵血紅素、Glu、Fe2+、Mn2+)對重組TfuDyP酶活影響結果是一致的，即添加劑是通過影響血紅素合成來影響重組TfuDyP催化活性，添加劑對血紅素飽和度影響與對比酶活影響成正相關性。DyPs作為一種新型過氧化物酶，在染料降解等領域具有潛在價值，如何提高重組DyPs的活性和產率成為其是否能實現工業應用的關鍵。通常采用的血紅素前體添加物如5-ALA價格較貴[19]，而且不總是能夠達到提高酶活的效果[13, 21]。本文通過研究外源添加物對血紅素飽和度和酶活性的關系，尋找最佳的添加劑量和廉價的添加物如谷氨酸復合鐵，可為工業發酵提供理論基礎。