平喘方對哮喘模型小鼠pDC/cDC通路的干預作用研究

1.南京中醫藥大學無錫附屬醫院 江 蘇，無錫 2 14001 2.上海市中醫醫院

哮喘是小兒常見肺系疾病，中醫認為哮喘的發生機制是“內有壅塞之氣，膈有膠固之痰，外有非時之感，三者相合，閉拒氣道，搏擊有聲，發為哮喘”[1]。平喘方是全國名老中醫虞堅爾教授在徐氏兒科第三代傳人朱瑞群教授臨床經驗基礎上結合自身學術特點而創制的，該方立足于哮喘發病之本——“伏痰夙瘀”，標本兼治，宣肺降氣以定其喘，化痰以治其本，兼化瘀以撼其根，以恢復肺之宣降功能，達到平喘之目的，臨床療效顯著。前期研究發現，平喘方可以影響T細胞的分化，從而減輕氣道炎癥[2]，但是其具體作用環節尚不清楚。本實驗旨在考察平喘方對哮喘模型小鼠樹突狀細胞（dendritic cell，DC）的兩種亞型即漿細胞樣DC（plasmacytoid DC，pDC）和傳統DC（conventional DC，cDC）的平衡的干預作用，探討其對T細胞分化的影響環節。

1 材料和方法

1.1實驗動物 清潔級雄性BALB/c小鼠40只，4～6周齡，體質量16～18g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供 [實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2008-0016]，飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2014-0008]。所有小鼠均在室溫22℃、濕度50%～70%的環境中飼養，自由飲水與進食。

1.2中藥 由上海萬仕誠國藥制品有限公司提供。

1.3主要試劑和儀器 地塞米松購于上海信宜有限公司（批號：110302）；雞卵白蛋白（ovalbumin，OVA）購于上海駿惠化工有限公司（批號：20120418）；ELISA酶聯免疫試劑盒由RD公司進口分裝（批號：20171205）；10%甲醛、TEMED及HE染色劑均購于國藥集團化學試劑有限公司（批號：20120320、ST728、20170927）；山羊血清封閉液、DAB顯色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、HRP標記的抗生物素抗體、電泳緩沖液、Marker、PBS緩沖液、二抗均購于碧云天生物科技有限公司 （批號：P0102、ST033、P0010、P0211、P0021A、P0067、ST-476、A0216）；47kDa 叉頭蛋白 P3（forkhead box P3，FOXP3）抗體購于美國Epitomics公司（批號：20171101）；52kDa維甲酸相關孤兒受體（retinoid-related orphan nuclear receptor，RORγt）抗體購于美國 Millipore公司（批號：20171018）；Masson染色劑購于南京建成科技有限公司（批號：171615）；cDNA合成試劑盒購于Fermentas公司（批號：20171112）；Trizol試劑購于Invitrogen公司（批號：20170125）；Real-time PCR Mix購于美國ABI公司（批號：20170502）。

RM2235石蠟切片機購于Leica公司；BX51型熒光顯微鏡購于Olympus公司；ABI-7500型PCR儀為美國ABI公司產品；Mini PROTEAN 3 cell電泳儀為BIO-RAD公司產品；PS-9電轉儀購于大連競邁科技有限公司。

1.4方法

1.4.1動物分組及模型制備 將40只BALB/c小鼠隨機分為空白組、模型組、地米組和平喘方組，每組10只。10%OVA致敏液由10g OVA、1g氫氧化鋁、100mL蒸餾水配成，即配即用。除空白組外，其他3組小鼠按50mL/kg的劑量腹腔注射10%OVA致敏液，空白組腹腔注射相同劑量的0.9%氯化鈉溶液，每2周1次，共注射2次。末次注射1周后，除空白組外，其他3組小鼠均以5g OVA+100mL蒸餾水配制的5%OVA進行致敏霧化，空白組采用0.9%氯化鈉溶液進行霧化，每次40min，1次/d，共1周。

1.4.2藥物制備 平喘方方劑組成：炙麻黃5g、苦杏仁 10g、炙甘草 5g、炙蘇子 10g、萊菔子 10g、大桃仁10g、淡子芩10g等。藥物參考李儀奎[3]《中藥藥理實驗方法學》及臨床實際應用的方法煎煮提取，第1次加13倍水旺火煮沸后，溫火煮30min，將藥液濾出；第2次加入11倍水旺火煮沸后，溫火煮30min，將藥液濾出。將2次濾液合并濃縮，加入適量95%乙醇，乙醇具體加入量依據公式V×60/（95-60）計算。冷藏靜置24h后濾出，將濾液濃縮至流浸膏樣，配制至生藥濃度 5.33g·mL-1。

1.4.3給藥方法 各組小鼠于致敏霧化當天開始用藥，平喘方組按1.4.2中的濃度，以20mL/kg·d的劑量灌胃；空白組和模型組以等劑量蒸餾水灌胃；地米組以蒸餾水將地塞米松片配制成濃度為0.075mg·mL-1的溶液，按等劑量灌胃。

1.4.4氣道炎癥指標檢測

1.4.4.1ELISA法檢測小鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中炎癥因子的含量各組灌胃1周后處死小鼠，收集BALF，以ELISA法測定白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、白細胞介素-23（interleukin-23，IL-23） 及轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的含量。

1.4.4.2Western blot檢測小鼠肺組織中 RORγt、FOXP3的蛋白表達 各組灌胃1周后處死小鼠，分離右側肺組織，采用Western blot檢測肺組織中RORγt、FOXP3的蛋白表達量。

1.4.4.3Real-time PCR檢測小鼠肺組織中吲哚胺-2，3-二氧化酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）、腫瘤壞死因子超家族4（tumor necrosis factor superfamily4，TNFSF4）的基因表達 各組灌胃1周后處死小鼠，分離右側肺組織，以Real-time PCR檢測肺組織中IDO、TNFSF4的基因表達。反應體系如下：將制備好的cDNA進行PCR擴增，擴增體系總體積50μL，具體組成如下：Real-time PCR Mix 32.0μL、IDO、TNFSF4、上下 游 引 物 各 0.5μL、TaqMan Probe0.5μL、ddH2O 14.5μL、cDNA 模板 2μL。反應條件：95℃ 5min；95℃15s，60℃45s（采集熒光），共40個循環。以β-actin為內參照，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。引物均由上海捷瑞生物工程公司設計合成，序列見表1。

1.4.5氣道重建指標檢測 各組灌胃1周后處死小鼠，取左側肺組織放入凍存管中，以10%甲醛固定，以備切片。將肺組織進行Masson染色，鏡下檢測膠原蛋白面積，以及支氣管基底膜周長（perimeter of bronchial basement membrane，Pbm）、支氣管壁面積（bronchial wall area，Wat）和氣道平滑肌面積（airway smooth muscle area，Wam）。400倍光學顯微鏡下挑選3支有完整橫斷面的中小支氣管，采用圖像采集系統獲取圖像，以Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量Pbm、支氣管總面積（Wat1）、管腔面積（Wat2）、平滑肌外緣內氣道面積（Wam1）、平滑肌內緣內氣道面積（Wam2），并用 Pbm 標準化，分別以（Wam1-Wam2）/Pbm和（Wat1-Wat2）/Pbm來計算氣道平滑肌面積（airway smooth muscle area，WAm）和氣道內壁面積（airway inner wall area，WAi）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5統計學分析 應用SPSS 18.0統計軟件進行統計學分析，服從正態分布且方差齊的計量資料，組間比較采用方差分析及LSD多重比較，若方差不齊則先進行轉換，再采用方差分析及LSD多重比較。相關性分析采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組小鼠一般情況比較 空白組小鼠呼吸均勻，活動正常，毛皮順滑干燥，二便正常，進食及飲水正常。模型組霧化激發后出現呼吸急促，腹肌抽搐，抓撓皮膚，二便失禁，毛發豎起、潮濕欠光澤，驚恐易激惹等現象，飲食及活動減少。平喘方組和地米組小鼠毛色稍順，活動自如，平喘方組體重增加，地米組體重稍有減輕。

2.2各組小鼠肺組織病理學改變比較 空白組支氣管壁結構完整光滑，細胞排列整齊，管腔內及管周未見明顯異常表現。模型組支氣管變形，管徑變窄，呈現菊花樣改變，管腔內有大量的炎性滲出物，管周有大量的炎性細胞浸潤及堆積。地米組支氣管壁結構完整，管周有少許的炎性細胞浸潤。平喘方組支氣管管徑正常，管壁結構稍有破損，管腔內及管周有少許炎性細胞浸潤。見圖1。

2.3用藥1周后各組小鼠BALF中IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β的含量比較 與空白組比較，模型組BALF中 IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β 含量均增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，地米組、平喘方組的 BALF 中 IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β 含量均減低（P＜0.05）。與地米組比較，除IL-17外，平喘方組其他指標均增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

圖1 各組小鼠肺組織病理切片（HE染色，400×）Fig.1 Pathological sections of lung tissue in each group(HE staining，400×)

表2 各組小鼠 BALF 中 IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β 的含量比較（±s）Tab.2 Comparison of the contents of IL-6,IL-17,IL-23 and TGF-β in BALF in each group(±s)

表2 各組小鼠 BALF 中 IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β 的含量比較（±s）Tab.2 Comparison of the contents of IL-6,IL-17,IL-23 and TGF-β in BALF in each group(±s)

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與地米組比較，△P＜0.05Note：Compared with blank group，*P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05；compared with dexamethasone group，△P＜0.05

13.91±11.3 6 114.31±2 8.31 * 2 3.94±14.61*#60.16±30.84*#△組別 n IL-6（ng·L-1） IL-17（pg·mL-1） IL-23（pg·mL-1） TGF-β（ng·L-1）空白組模型組地米組平喘方組10 10 10 1 0 4.85±2.42 83 .35±19.28*12.90±5.64*#32.3 7±23.19*#△2.97±1.2 8 48.13±7.36*16.03±8.99*#14.80±7.53*#7.46±4.61 121 .70±28.46*13.74±6.01*#35.16±15.35*#△

2.4用藥1周后各組小鼠肺組織中RORγt和FOXP3的蛋白表達量比較 與空白組比較，模型組肺組織中RORγt蛋白表達量增高，FOXP3表達量減低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，地米組、平喘方組肺組織中RORγt蛋白表達量減低，FOXP3表達量增高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與地米組比較，平喘方組RORγt和FOXP3蛋白表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 3、圖 2。

2.5用藥1周后各組小鼠肺組織中IDO和TNFSF4基因表達量比較 與空白組比較，模型組肺組織中IDO的基因表達量降低，TNFSF4的基因表達量增高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，地米組、平喘方組肺組織中IDO基因表達量增高，TNFSF4基因表達量的基因表達量降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與地米組比較，平喘方組中的IDO、TNFSF4基因表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表3 各組小鼠肺組織中RORγt和FOXP3蛋白表達量比較（±s）Tab.3 Comparison of RORγt and FOXP3 protein expression of lung tissue in each group（±s）

表3 各組小鼠肺組織中RORγt和FOXP3蛋白表達量比較（±s）Tab.3 Comparison of RORγt and FOXP3 protein expression of lung tissue in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：Compared with blank group，*P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05

0.78±0.15 0.43±0.10*0.65±0.10*#0.59±0.09*#組別 n RORγt FOXP3空白組模型組地米組平喘方組10 10 10 1 0 0.46±0.12 0.78±0.06*0.60±0.09#0.65±0.08*#

圖2 Western blot檢測各組小鼠肺組織RORγt和FOXP3蛋白表達Fig.2 Detection of RORγt and FOXP3 protein expression of lung tissue in each group by Western blot

2.6指標之間的相關性分析

2.6.1IL-17與RORγt、FOXP3之間的相關性分析

Pearson相關性分析提示，IL-17與RORγt呈正相關，與FOXP3呈負相關。見表5。

2.6.2IL-23 與 RORγt、FOXP3、TNFSF4 和 IDO 之間的相關性分析 Pearson相關性分析提示，IL-23與RORγt呈正相關，與FOXP3呈負相關；與TNFSF4呈正相關，與IDO呈負相關。見表6。

表4 各組小鼠肺組織中IDO和TNFSF4基因表達量比較（±s）Tab.4 Comparison of IDO and TNFSF4 gene expression of lung tissue in each group（±s）

表4 各組小鼠肺組織中IDO和TNFSF4基因表達量比較（±s）Tab.4 Comparison of IDO and TNFSF4 gene expression of lung tissue in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：Compared with blank group，*P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05

0.26±0.17 1.3 2±0.29*0.52±0.18*#0.42±0.21#組別 n IDO TNFSF4空白組模型組地米組平喘方組10 10 10 1 0 1.84±0.42 0.41±0.07*1.5 3±0.62 # 1.2 1±0.57#

表5 IL-17與RORγt、FOXP3的相關性分析Tab.5 Analysis of correlation between IL-17 and RORγt,FOXP3

2.6.3RORγt與TNFSF4、IDO之間的相關性分析

Pearson相關性分析提示，RORγt與TNFSF4呈正相關，與IDO呈負相關。見表7。

表6 IL-23 與 RORγt、FOXP3、TNFSF4、IDO 的相關性分析Tab.6 Analysis of correlation between IL-23 and RORγt,FOXP3,TNFSF4,IDO

表7 RORγt與TNFSF4,IDO的相關性分析Tab.7 Analysis of correlation between RORγt and TNFSF4,IDO

2.6.4FOXP3與TNFSF4、IDO之間的相關性分析

Pearson相關性分析提示，FOXP3與TNFSF4呈負相關，與IDO呈正相關。見表8。

2.7用藥1周后各組小鼠肺組織中膠原蛋白面積比較 與空白組比較，模型組、地米組、平喘方組的肺組織中膠原蛋白面積增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，地米組、平喘方組的肺組織中膠原蛋白面積減低（P＜0.05）。與地米組比較，平喘方組的肺組織中膠原蛋白面積差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 9、圖 3。

表8 FOXP3與TNFSF4、IDO的相關性分析Tab.8 Analysis of correlation between FOXP3 and TNFSF4,IDO

表9 各組小鼠肺組織中膠原蛋白面積比較(±s，%)Tab.9 Comparison of collagen area of lung tissues in each group(±s，%)

表9 各組小鼠肺組織中膠原蛋白面積比較(±s，%)Tab.9 Comparison of collagen area of lung tissues in each group(±s，%)

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：Compared with blank group，*P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05

組別n 膠原蛋白面積17.60±2.07 38.00±2.92 * 2 6.40±3.36*#29.00±3.39*#空白組模型組地米組平喘方組5 5 5 5

2.8用藥1周后各組小鼠肺組織中WAm、WAi比較與空白組比較，模型組肺組織WAm和WAi均增大（P＜0.01），地米組WAm和WAi差異無統計學意義（P＞0.05），平喘方組 WAm 增大（P＜0.01），而 WAi差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，地米組、平喘方組的WAm和WAi均減?。≒＜0.01）。與地米組比較，平喘方組小鼠肺組織中WAm和WAi差異無統計學意義（P＞0.05）。見表10。

3 討論

自從1969年研究發現氣道中嗜酸粒細胞的增多是由淋巴細胞介導以來，隨著氣道炎癥學說的發展，輔助性T淋巴細胞Th1/Th2亞群比例和功能失衡成為哮喘的經典發病機制。Th17是一種特殊的T細胞功能群，由該群細胞分泌的前炎性因子IL-17而命名，可以調節自身免疫、炎癥和黏膜的防御反應。IL-17可以促進嗜中性粒細胞的募集并促進組織炎癥的發生。Th17細胞本身不會引起嗜酸性細胞增多，從而導致氣道炎癥，但是IL23-Th17細胞軸可以加強Th2細胞優勢應答介導的氣道炎癥。Treg細胞是一類抑制性T細胞，其在維持免疫內環境穩態和調節效應T應答中發揮著重要的作用。Treg細胞與Th17細胞起源于同一前體細胞，FOXP3和RORγt分別是Treg細胞和Th17細胞的關鍵性轉錄因子及種系特異性標志[4]，而FOXP3和RORγt的平衡也決定T細胞的分化類型，兩者均由TGF-β啟動。DC是具有抗原遞呈功能的專職抗原遞呈細胞。氣道內存在兩類DC，cDC通過高度表達TNFSF4，刺激原始T細胞向Th2、Th17細胞的分化，發生免疫應答，促進氣道炎癥；而pDC高度表達IDO，刺激Treg細胞分化產生，調節肺部免疫耐受的形成[5]。

圖3 各組小鼠肺組織中膠原蛋白面積（Masson染色，400×）Fig.3 Collagen area of lung tissue in each group(Masson staining，400×)

表10 各組小鼠肺組織中 WAm、WAi比較（±s，μm2·μm-1）Tab.10 Comparison of WAm and WAi of lung tissue in each group(±s,μm2·μm-1)

表10 各組小鼠肺組織中 WAm、WAi比較（±s，μm2·μm-1）Tab.10 Comparison of WAm and WAi of lung tissue in each group(±s,μm2·μm-1)

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01Note：Compared with blank group，**P＜0.01；compared with model group，##P＜0.01

17.69±2.3 4 33.57±6.83**20.22±7.17##22.11±3 .98##組別 n WAm WAi空白組模型組地米組平喘方組10 10 10 1 0 29.60±10.57 75.23±28.98**35.23±12.3 6##48.02±2 2.45**##

TNFSF4又名 OX40配體（OX40 ligand，OX40L）、糖 蛋 白 34 （glycoprotein 34，gp34）、CD134 配 體（CD134 Ligand，CD134L），是腫瘤壞死因子超家族成員之一，為Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要表達于活化的細胞，如成熟DC、活化B細胞、血管內皮細胞等，與受體結合后，可以調節CD4+和CD8+T細胞的活化及增殖，促使Th0細胞向Th2、Th17細胞分化，并且可以延長免疫應答效應，抑制T細胞凋亡[6-7]。IDO是一種含鐵血紅素單體蛋白，可以促進CD4+T細胞轉化為FOXP3+的Treg細胞，而且可以誘導致其快速活化，抑制IL-17的分泌[8-9]。Kumar等[10]認為通過IDO誘導并擴增Treg細胞是重建免疫耐受的經典途徑。本研究相關性分析提示，TNFSF4可以正向調節RORγt，負向調節FOXP3，從而促使T細胞向Th17細胞轉化，分泌IL-17及IL-23，促進氣道炎癥；而IDO負向調節 RORγt，正向調節FOXP3，促使 T細胞向 Treg細胞轉化，加強免疫耐受。

古人認為痰飲為津液所化，與水同類，具有很強的流動性。若膈之“膠固之痰”隨氣而動，當痰氣交阻于肺，礙肺氣宣降，即發為哮喘。津血同源，二者之間相互資生、相互轉化，病理上相互影響、相互傳變，因此，痰和瘀易于互結。若痰瘀互結，可使痰飲難化，瘀血難除，固著于肺，致使哮喘反復發作，纏綿難愈。因此課題組認為痰氣交阻是哮喘發作的關鍵，痰瘀互結是哮喘難治的重點。平喘方是虞堅爾教授立足于“伏痰夙瘀”的病機而創制的，由炙麻黃、苦杏仁、紫蘇子、大桃仁、萊菔子、淡子芩、炙甘草等組成。方中炙麻黃宣肺平喘，苦杏仁降氣平喘，兩者相配一宣一降；紫蘇子辛溫，可以溫散痰飲，使水上行；萊菔子長于降氣祛痰定喘，與紫蘇子相伍，亦是一宣一降，四藥相合疏利痰氣，迅速恢復肺之氣機；大桃仁活血化瘀，撼哮喘之本，阻于痰瘀互結；黃芩佐制方中他藥之溫燥之性，使痰濕得化而不致傷及陰津。整方宣降通用，與肺之宣降功能同性相求，化痰與祛瘀同用，相輔相成。本研究發現，平喘方可以恢復pDC/cDC的平衡，促進IDO表達，抑制TNFSF4表達，進而促使T細胞向Treg細胞分化，從而影響Treg/Th17細胞的分化平衡，誘導免疫耐受，降低氣道炎癥；同時平喘方可以使哮喘模型小鼠的膠原蛋白面積、WAm和WAi減少，從而改善氣道重建。

現代藥理研究發現，麻黃中的主要成分麻黃堿有擬腎上腺素樣作用，可通過釋放遞質發揮間接作用，也可以直接激動α及β-腎上腺素能受體，松弛支氣管平滑肌，興奮心肌，升高血壓[11]?？嘈尤始按筇胰手泻锌嘈尤受?，其可明顯減少卵白蛋白致豚鼠哮喘模型的炎癥細胞數量，抑制舒縮性介質和炎性因子水平的升高，從而能夠鎮咳平喘[12]。大桃仁還具有抗凝血、抗炎、抗過敏等作用[13]。紫蘇子的成分紫蘇油中的脂肪酸類具有抗過敏、抗炎功效，且其機制與抑制血小板活化因子和白細胞三烯（leucotriene，LT）產生有關；同時還能夠抑制血小板聚集，防止血栓形成[14]。萊菔子中含有芥子堿，能夠通過擴張氣道平滑肌增加肺和氣管容量[15]。黃芩的成分黃芩苷可以顯著抑制白細胞內LTB4和LTC4的生物合成[16]，還能夠抑制血小板聚集，抑制凝血酶誘導的纖維蛋白產生[17]。

綜上所述，平喘方可以恢復pDC/cDC的平衡，誘導免疫耐受，降低氣道炎癥，同時還能改善氣道重建。從現代藥理看，該方中既有擴張支氣管平滑肌的成分，又有抗過敏的成分，至于其作用于DC中的哪些具體靶點，作用機制如何，尚需進一步研究。