D-氨基半乳糖改性對玉米谷蛋白結構性質及抗氧化活性的影響

王曉杰 曲 悅 劉曉蘭 叢萬鎖

(1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院,黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

玉米中含有64%～78%的淀粉，通常作為生產淀粉的原料。在濕磨法玉米淀粉生產過程中，產生了玉米加工量6.12%的玉米蛋白粉。玉米蛋白粉中含有4種溶解性不同的蛋白質，分別為醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白[1]。其中，玉米谷蛋白是由20多種分子量在11～127 kDa的蛋白質亞基通過二硫鍵等緊密結合而形成的巨大、復雜的大分子蛋白質，其不溶于中性水溶液和乙醇溶液，僅溶于稀酸或稀堿溶液[2]。玉米谷蛋白水溶性差的特性限制了這一量大、廉價、有優良功能潛力的植物蛋白在食品工業的應用。

目前，為了提高玉米蛋白的水溶性，主要采用化學法對其進行改性處理，包括磷酸化[3]、琥珀?；痆4]與糖基化[5-6]等。其中，糖基化改性是利用糖類物質的多羥基特性改善食物蛋白質的親水—親油平衡，進而改善蛋白質在水相中的溶解性等功能特性，采用的方法包括美拉德反應和酶法糖基化。其中，酶法糖基化改性具有反應特異性強、反應條件溫和、產物食用安全等優點，已成功應用于大豆蛋白[7]、酪蛋白[8]、乳清蛋白[9]、豌豆蛋白[10]、燕麥麩皮球蛋白[11]等食物蛋白質的改性中，顯示出良好的應用優勢與前景。

酶法糖基化改性是以轉谷氨酰胺酶(TGase)為催化劑，利用其?；D移能力催化氨基糖與蛋白質中谷氨酰胺殘基之間異肽鍵的形成。玉米谷蛋白中谷氨酰胺殘基含量高達34%[12]，是酶法糖基化改性的良好底物。但到目前為止，僅見用殼寡糖對玉米谷蛋白進行糖基化改性的報道[13]。未見對改性產物的結構和功能性質進行的研究，也未見用其他氨基糖對玉米谷蛋白進行改性的報道。在前期研究工作中，本課題組已經建立了TGase和D-氨基半乳糖改性玉米谷蛋白的反應體系。在此基礎上，本試驗擬以D-氨基半乳糖糖基化改性玉米谷蛋白為原料，研究糖基化改性對玉米谷蛋白結構性質及抗氧化活性的影響，為糖基化改性玉米谷蛋白在功能性食品領域的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

D-氨基半乳糖：分析純，上海御略化工有限公司；

TGase：食品級，酶活力1 000 U/g，泰興市一鳴生物制品有限公司；

鄰苯二甲醛、菲洛嗪、硫代巴比妥酸：分析純，上海生工生物有限公司；

DPPH、2-脫氧-D-核糖：分析純，美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器設備

差示掃描量熱儀：Q-20型，美國TA儀器有限公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：Spectrum One型，美國Perkin Elmer公司；

雙光束紫外可見分光光度計：TU1901型，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米谷蛋白的提取 參照文獻[13]。玉米蛋白粉經擠壓膨化、去淀粉和脫色處理后，用70%乙醇萃取兩次。將兩次萃取后的沉淀按1∶10(g/mL)加入0.1 mol/L NaOH溶液，50～60 ℃條件下水浴振蕩2 h。水浴結束后，4 500 r/min離心10 min，沉淀再用相同條件萃取1次，將兩次上清液合并。調節上清液pH至4.5～4.8，4 500 r/min 離心10 min，沉淀用70%乙醇靜置洗滌兩次，水洗兩次，取沉淀烘干，獲得玉米谷蛋白。

1.2.2 糖基化玉米谷蛋白的制備 向底物濃度為3 g/100 mL 的玉米谷蛋白懸浮液中添加D-氨基半乳糖(?；w與?；荏w的物質的量比為1∶3)，按35 U/g·蛋白的加酶量加入TGase，在pH 7.7、44 ℃條件下反應4 h。反應結束后，85 ℃熱處理5 min，鈍化反應體系中的TGase。冷卻至室溫，用截斷分子質量1 000 Da的透析袋除去反應體系中未反應的氨基糖。透析后的樣品經冷凍干燥后獲得糖基化玉米谷蛋白，貯存在干燥器中備用。

1.2.3 玉米谷蛋白及其糖基化改性產物游離氨基含量的測定 采用鄰苯二甲醛(OPA)法[14]。取3 mL一定濃度的待測樣品，與同體積的OPA溶液混合，反應5 min后測定340 nm處的吸光度值。利用L-亮氨酸標準曲線(y=2.583x+0.002，R2=0.999)計算樣品中游離氨基的含量。

1.2.4 玉米谷蛋白及其糖基化改性產物的紅外光譜分析

采用KBr壓片法制備兩種待測樣品，測定波數為4 000～400 cm-1范圍內的紅外光譜，分辨率為4 cm-1。

1.2.5 玉米谷蛋白及其糖基化改性產物熱穩定性的測定

精確稱取2.0 mg樣品放入鋁盒中，壓蓋密封后在升溫速率10 ℃/min、溫度范圍20～190 ℃的條件下進行DSC掃描。通過變性峰的面積計算熱焓值，并得到相關蛋白的變性溫度。以密封空鋁盒作為對照。

1.2.6 玉米谷蛋白及其糖基化改性產物抗氧化活性的測定 抗氧化活性的測定指標包括3種自由基清除活性(包括DPPH、羥基和超氧陰離子自由基)、Fe2+螯合能力以及還原力，測定方法參照文獻[2]。

2 結果與討論

2.1 糖基化改性對玉米谷蛋白結構性質的影響

2.1.1 紅外光譜分析 在酶法糖基化改性研究中，普遍采用紅外光譜來鑒定氨基糖是否與底物蛋白質發生了共價結合。玉米谷蛋白及其糖基化改性產物的紅外光譜圖如圖1所示。

圖1 玉米谷蛋白及其糖基化改性產物的傅里葉變換紅外光譜圖Figure 1 Fourier transform infrared spectroscopy spectra of corn glutelin and its modified production by the glycosylation

由圖1可以看出，玉米谷蛋白及其糖基化改性產物的紅外光譜圖變化趨勢基本相同，僅在1 130～1 200 cm-1處略有差異，而1 200～1 000 cm-1間比較大的吸收峰是由兩種C—O伸縮振動所引起的，其中一種是屬于C—O—H的，另一種是糖環的C—O—C官能團的伸縮振動和糖環存在的典型特征[15]。說明在TGase的催化下，D-氨基半乳糖與玉米谷蛋白發生了共價結合，但糖基結合量相對較低。

2.1.2 DSC分析 采用DSC考察糖基化改性對玉米谷蛋白熱穩定性的影響，結果如圖2和表1所示。

圖2 玉米谷蛋白及其糖基化改性產物的DSC曲線Figure 2 DSC profile of corn glutelin and its modified production by the glycosylation

表1 糖基化改性對玉米谷蛋白變性溫度和熱變性焓的影響Table 1 Effect of the glycosylation modification on the denaturation temperature and enthalpy of thermal denaturation of corn glutelin (n=3)

由圖2可以看出，與玉米谷蛋白相比，糖基化改性產物的DSC曲線變淺，且波谷向左移動。由表1可知，玉米谷蛋白的變性溫度及變性焓值分別為119.9 ℃和280.27 J/g，說明玉米谷蛋白具有較高的熱穩定性，與其結構緊密的特點相符。與玉米谷蛋白相比，糖基化改性玉米谷蛋白的變性溫度及變性焓分別降低9.03 ℃和68.74 J/g，說明糖基化改性使玉米谷蛋白由有序結構轉變為無序結構，此時谷蛋白的結構較為松散，熱穩定性降低。這一結果與糖基化改性燕麥麩皮中的球蛋白結果[11]一致，但與玉米醇溶蛋白的糖基化改性結果[16]相矛盾，可能與底物蛋白質的本身結構有關。

2.1.3 游離氨基含量 玉米谷蛋白及其糖基化改性產物的游離氨基含量的測定結果如表2所示。

由表2可以看出，玉米谷蛋白的游離氨基含量僅為32 mmol/kg·蛋白，進一步說明了玉米谷蛋白的結構緊密，將含有氨基的酰胺基氨基酸埋藏在分子內部。在糖基化改性過程中，糖基化玉米谷蛋白的游離氨基含量顯著增加，達190 mmol/kg·蛋白，與美拉德反應及大豆酶法糖基化改性的結果相矛盾[8,17]，可能是糖基化改性使玉米谷蛋白本身緊密的結構變得松散，使分子內部暴露出的游離氨基的含量遠大于糖基化反應損耗的游離氨基的含量，導致雖然酶法糖基化反應發生，但游離氨基含量增加，與2.1.1紅外光譜分析的結論一致，即D-氨基半乳糖雖然與玉米谷蛋白發生了結合，但結合量較低。

表2糖基化改性對玉米谷蛋白游離氨基含量的影響
Table 2Effect of the glycosylation modification on the free amino groups content of corn glutelin(n=3)

樣品名稱游離氨基含量/(mmol·kg-1·Prot)玉米谷蛋白 32.23±0.51糖基化玉米谷蛋白190.05±0.04

2.2 糖基化改性對玉米谷蛋白抗氧化活性的影響

2.2.1 DPPH自由基清除率 以玉米谷蛋白為對照，測定不同濃度下糖基化改性玉米谷蛋白對DPPH自由基的清除能力，結果如圖3所示。

圖3 糖基化改性和蛋白濃度對玉米谷蛋白DPPH自由基清除率的影響Figure 3 Effect of the modification and protein content on the DPPH radical scavenging capacity of corn glutelin

由圖3可知，玉米谷蛋白及其糖基化改性產物的DPPH 自由基清除率均隨著樣品濃度的增加而逐漸增大，且糖基化改性產物清除DPPH自由基的能力高于玉米谷蛋白。在濃度為2 mg/mL時，糖基化玉米谷蛋白的DPPH自由基清除率為74.49%，比玉米谷蛋白高8.23%。玉米谷蛋白及其糖基化產物清除DPPH自由基的EC50值分別為0.71，0.68 mg/mL，說明TGase和D-氨基半乳糖的改性改善了玉米谷蛋白清除DPPH自由基的能力。分析可能有兩方面的原因：① 糖基化改性產物可以向DPPH自由基提供氫原子，使之形成穩定的非活性化合物DPPH-H；② 糖基化改性使谷蛋白分子結構展開，暴露出更多的疏水基團，這些疏水性基團更易與脂溶性的DPPH自由基反應，從而提升了對DPPH自由基的清除能力。

2.2.2 羥基自由基清除率 分別測定玉米谷蛋白及其糖基化改性產物的羥基自由基清除率，結果如圖4所示。

圖4 糖基化改性和蛋白濃度對玉米谷蛋白羥基自由基清除率的影響Figure 4 Effect of the modification and protein content on the hydroxyl radical scavenging capacity of corn glutelin

由圖4可知，糖基化改性前后玉米谷蛋白均具有清除羥基自由基的能力，且同一濃度下，糖基化玉米谷蛋白的羥基自由基清除率均高于玉米谷蛋白，可能是糖基化玉米谷蛋白既是良好的供氫體，也是亞鐵離子螯合劑，能通過抑制Fenton反應而減少羥基和超氧陰離子自由基的生成，提高自由基的清除能力[18]。

2.2.3 超氧陰離子自由基清除活性 不同濃度下兩種待測樣本的超氧陰離子自由基清除率如圖5所示。

由圖5可知，與玉米谷蛋白相比，D-氨基半乳糖的糖基化改性使玉米谷蛋白清除超氧陰離子自由基的能力增強。在濃度為2 mg/mL時，糖基化產物的清除率為13.26%，比玉米谷蛋白高6.10%。這可能是因為糖基化改性產物分子中抗氧化活性的氨基酸與D-氨基半乳糖的伯、仲—OH的協同作用使鄰苯三酚在自氧化初期產生的超氧陰離子自由基形成穩定的分子，或者與一些過氧化物的前體物反應阻止過氧化物的生成，從而有效地阻斷了自由基的反應鏈。

圖5 糖基化改性和蛋白濃度玉米谷蛋白超氧陰離子自由基清除率的影響Figure 5 Effect of the modification and protein content on the superoxide radical scavenging capacity of corn glutelin

2.2.4 還原力 分別測定玉米谷蛋白及其糖基化改性產物在700 nm處的吸光度值，以表征兩種待測樣品的還原能力，結果如圖6所示。

圖6 糖基化改性和蛋白濃度對玉米谷蛋白還原力的影響Figure 6 Effect of the modification and protein content on the reducing power of corn glutelin

由圖6可知，玉米谷蛋白具有還原力，但能力較弱，可能與玉米谷蛋白的結構緊密、抗氧化氨基酸埋藏在分子內有關。經D-氨基半乳糖改性后，玉米谷蛋白的還原力顯著增加，在濃度為2 mg/mL時，糖基化改性產物的還原力為0.60，比同濃度玉米谷蛋白提高0.44。這可能是糖基化改性產物可以提供電子將Fe3+還原成Fe2+，使Fe2+發生Perl’s Prussian藍反應，使普魯士藍的生成量增加，700 nm處吸光值升高，糖基化樣品的還原力增強[17]。

2.2.5 Fe2+螯合能力 分別測定玉米谷蛋白及D-氨基半乳糖糖基化改性產物的Fe2+螯合能力，結果如圖7所示。

由圖7可以看出，玉米谷蛋白具有較強的Fe2+螯合能力，在濃度為2 mg/mL時，其螯合率達31.23%，可能與玉米谷蛋白的長鏈結構有關。與玉米谷蛋白相比，糖基化改性使玉米谷蛋白Fe2+螯合能力進一步增加，兩者螯合Fe2+的EC50值分別為2.94，1.67 mg/mL。分析可能的原因是糖基化改性使玉米谷蛋白的結構發生改變，谷氨酰胺殘基上的一些配位能力較強的基團例如羰基(—C═O)裸露出來，更易于與Fe2+發生絡合反應，因此糖基化改性玉米谷蛋白可以通過螯合Fe2+來阻止Fe2+與H2O2反應產生羥基自由基，從而消除自由基對機體造成的氧化性損傷，與2.2.2的結果相一致。

圖7 糖基化改性和蛋白濃度對玉米谷蛋白Fe2+-螯合能力的影響Figure 7 Effect of the modification and protein content on the Fe2+-chelating capacity of corn glutelin

3 結論

玉米谷蛋白是結構緊密、分子量巨大而復雜的大分子蛋白質，其溶于稀酸堿性溶液的特性限制了其在食品工業中的應用。本試驗利用TGase和D-氨基半乳糖對玉米谷蛋白進行糖基化改性，研究了糖基化改性對玉米谷蛋白結構性質和抗氧化活性的影響。紅外光譜的測定結果表明，在TGase的催化下，玉米谷蛋白與D-氨基半乳糖發生了共價結合，但結合量較低。與玉米谷蛋白相比，D-氨基半乳糖的共價結合使玉米谷蛋白的結構變得無序而松散，熱穩定性降低；同時，糖基化改性使玉米谷蛋白的抗氧化活性顯著提高，說明酶法糖基化是一種適合于對玉米谷蛋白進行改性的有效方法。在此基礎上，可以采用細胞試驗和動物試驗進一步研究糖基化玉米谷蛋白的毒性及生理功能特性，這對糖基化玉米谷蛋白能否成功應用于食品工業具有重要意義。