耿正瑋,樊林娟,張詠梅,程艷芬,馮翠萍,*
(1.山西農業大學食品科學與工程學院,山西晉中030801;2.臨汾市國有企業監事會,山西臨汾041000)
杏鮑菇又名刺芹側耳,是歐洲南部、非洲北部以及中亞地區高山、草原、沙漠地帶的一種品質優良的大型肉質傘菌,其味道鮮美、營養價值豐富,對人體具有抗衰老[1]、抗氧化[2]、抗病毒[3]、抗腫瘤[4]等生理功效。杏鮑菇中的蛋白質含量約12.4%~35%,8種必需氨基酸齊全,是一種營養價值很高的食用菌[5]。魏君慧等[6]采用Osborne法分離杏鮑菇中的主要蛋白組分,并研究其理化性質和功能特性。陳雪洋等[7]通過干燥、粉碎、堿提、酸沉、回調、凍干等工藝提取杏鮑菇蛋白質,并對其功能特性進行了分析。本課題組前期試驗結果表明:杏鮑菇中谷蛋白含量占總蛋白含量的30.71%,關于谷蛋白的理化性質和功能特性鮮見報道。因此,本試驗以杏鮑菇粉為原料,采用Osborne法分離出杏鮑菇谷蛋白,對其分子量、二級結構、巰基含量、變性溫度及氨基酸組成進行測定,并研究離子強度、溫度、pH值、蔗糖濃度對其功能特性的影響,為杏鮑菇谷蛋白質在食品加工中的應用提供理論依據。
杏鮑菇粉:山西農業大學食用菌中心提供;考馬斯亮藍G-250染料試劑:上海源葉生物科技有限公司;5,5,-二硫雙(2-硝基苯甲酸)[5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid),DTNB]、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS):美國 sigma 公司;色拉油:市售;其它試劑均為國產分析純。
HH-2型電子恒溫水浴鍋:天津市賽得利斯有限公司;ST3100型酸度計、AR224型電子分析天平:奧豪斯儀器(常州)有限公司;LD5-2B型高速離心機:北京雷勃爾醫療器械有限公司;UV-120型紫外-可見分光光度計:上海美譜達儀器有限公司;GZX-G型漩渦振動儀器:上海躍進醫療器械有限公司;Tensor傅里葉紅外變換光譜儀:Bruker;Lab Sys同步熱分析儀:法國SE TARAM;Biochro氨基酸自動分析儀:英國百康。
1.3.1 杏鮑菇谷蛋白的提取
稱取一定量的杏鮑菇粉,以蒸餾水為提取劑,先提取清蛋白,將提取清蛋白后的沉淀用3%NaCl浸提球蛋白,將提取球蛋白后的沉淀用70%乙醇浸提醇溶蛋白,將提取醇溶蛋白后的沉淀用1%NaOH浸提得到谷蛋白。
1.3.2 杏鮑菇谷蛋白理化性質研究
1.3.2.1 等電點的測定
將提取醇溶蛋白后的沉淀按一定的料液比加入0.01 mol/L NaOH溶液,調節pH值提取谷蛋白,離心后分別吸取10.0 mL上清液于9個離心管中,調節各上清液的pH值,以pH4.1開始按照0.1的梯度進行調節最終至5.0,在4500r/min離心20min,取上清液1.0mL,用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白質含量,蛋白質含量最低時的pH值即為等電點。
1.3.2.2 巰基含量的測定
1)二硫鍵的測定:
式中:A412為412 nm條件的吸光值;ε為分子吸光度13 900[(mol×cm)/L];D為稀釋倍數。
2)自由巰基的測定:
式中:A412為412 nm條件的吸光值;ε為分子吸光度13 900[(mol×cm)/L];D為稀釋倍數。
3)總巰基的測定:
式中:A412為412 nm條件的吸光值;ε為分子吸光度13 900[(mol×cm)/L];D為稀釋倍數。
1.3.2.3 二級結構的測定
取谷蛋白固體樣品2.0mg、光譜醇KBr約200.0mg,在瑪瑙研缽中研磨至細膩的粉末狀,取適量樣品分散系置于壓片模具中,將壓片模具置于壓片機上,在一定的壓力下壓制成薄片,在光譜儀中做全波長掃描。
1.3.2.4 變性溫度的測定
采用示差量熱掃描(differential scanning calorimetry,DSC)儀測定杏鮑菇谷蛋白變性溫度,稱取谷蛋白固體樣品10.0 mg于樣品皿中,用壓樣機封樣,進行掃描。
1.3.2.5 氨基酸組成的測定
參照GB/T 5009.124-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》方法,準確稱取杏鮑菇谷蛋白凍干粉,將蛋白質經鹽酸水解成游離氨基酸,利用氨基酸分析儀對杏鮑菇谷蛋白氨基酸進行測定。
1.3.3 杏鮑菇谷蛋白功能特性研究
1.3.3.1 離子強度對蛋白質功能特性的影響因素
配制濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的NaCl溶液,分別測定不同濃度的NaCl溶液對谷蛋白的溶解性(solubility,S),持水性(water holding capacity,WA),持油性(oil holding capacity,FA),起泡性(foam capability,FC)及起泡穩定性(foam stability,FS),乳化性(emulsion capability,EC)及其乳化穩定性(emulsification stability,ES)的影響。
1.3.3.2 溫度對蛋白質功能特性的影響因素
將處理好蛋白液置于溫度分別置于以30℃開始按照10℃梯度遞增到70℃的水浴鍋中,加熱10 min后取出,待其冷卻至25℃后,分別測定不同溫度對杏鮑菇谷蛋白S、WA、FA、FC及FS、EC及其ES的影響。
1.3.3.3 pH值對蛋白質功能特性的影響因素
將處理好的蛋白液,用0.01 mol/L的HCl或者NaOH調節溶液pH值,以pH 3.0開始按照0.5梯度遞增到5.0,分別測定不同pH值對杏鮑菇谷蛋白S、WA、FA、FC及FS、EC及其ES的影響。
1.3.3.4 蔗糖濃度對蛋白質功能特性的影響因素
分別配制濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的蔗糖溶液,測定不同濃度的蔗糖溶液對杏鮑菇谷蛋白S、WA、FA、FC及FS、EC及其ES的影響。
1.3.3.5 功能特性指標測定
1)蛋白含量的測定:采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量,根據標準曲線計算待測樣品中蛋白含量(g)。
2)溶解性:參照馮笑笑[8]的方法,用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白含量,按下式計算溶解性(S)。
3)持水性:參照龐庭才等[9]的方法,按下式計算蛋白質持水性(WA)。
式中:m為蛋白樣品質量,g;m1為離心管和蛋白樣品的質量,g;m2為離心管和沉淀物的質量,g。
4)持油性:參照張艷榮等[10]的方法,按下式計算蛋白質持油性(FA)。
式中:m為蛋白質樣品的質量,g;m1為離心管和蛋白質樣品的質量,g;m2為離心管和沉淀物的質量,g。
5)起泡性及起泡穩定性:照楊華連等[11]的方法,按下式計算其起泡性(FA)及起泡穩定性(FS)。
式中:V初始溶液體積,mL;V0為剪切后0 min的泡沫體積,mL;V30為剪切后30 min的泡沫體積,mL。
6)乳化性:參照林洋[12]方法,按下式計算蛋白質乳化穩定性(ES)及乳化穩定性(ES)。
每份樣品重復測定3次,取平均值,使用OriginPro8.5進行數據處理、分析。
2.1.1 等電點
杏鮑菇谷蛋白等電點見圖1。
圖1 杏鮑菇谷蛋白等電點Fig.1 The protein isoelectric point of Pleurotus eryngii gluten
由圖1可知,隨著蛋白液pH值的增加,溶液中蛋白含量先迅速減小,在pH值為4.3時蛋白含量達到最小,隨著pH值的增加,溶液中蛋白質含量趨于穩步的增長趨勢。
2.1.2 分子量
杏鮑菇谷蛋白分子量見圖2。
圖2 杏鮑菇谷蛋白SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE diagram of Pleurotus eryngii albumin and glutelin
由圖2可知,谷蛋白分布在30.28、25.39 kDa附近。
2.1.3 巰基含量
蛋白質的空間結構是通過巰基和二硫鍵維持的,二硫鍵和巰基可通過氧化還原進行相互的轉化,杏鮑菇谷蛋白巰基和二硫鍵含量見表1。
表1 谷蛋白的巰基和二硫鍵含量Table 1 Sulfhydryl and disulfide bond contents of glutenin
由表1可知,杏鮑菇谷蛋白總巰基含量為67.06 μmol/g,易與水結合。二硫鍵是一種共價鍵,它的形成使蛋白質肽鏈的空間結構更加緊密,其可通過還原反應轉化形成巰基,二硫鍵的減少使蛋白質的空間結構松散。杏鮑菇谷蛋白二硫鍵含量相對較高,說明谷蛋白具有很好的熱穩定性,在加工過程中熱穩定性高。
2.1.4 二級結構含量
杏鮑菇谷蛋白二級結構含量見圖3、表2。
圖3 杏鮑菇谷蛋白紅外光譜圖Fig.3 DSC scans of the Pleurotus eryngii glutenin
表2 杏鮑菇谷蛋白二級結構含量Table 2 Secondary structure contents of glutenin in Pleurotus eryngii
由圖3可見,2 000 cm-1~1 500 cm-1為雙鍵伸縮振動區,1 659、1 661 cm-1附近的峰說明杏鮑菇谷蛋白在酰胺Ⅰ帶有α螺旋;在1631cm-1附近出現的峰說明杏鮑菇谷蛋白在酰胺Ⅰ帶存在β折疊;在1 668、1 674 cm-1的峰證明杏鮑菇谷蛋白在酰胺Ⅰ帶存在β轉角,由表2可知,α-螺旋、β-折疊和β-轉角含量分別為31.41%、55.15%、13.45%。
2.1.5 熱變性溫度
杏鮑菇谷蛋白熱變性溫度見圖4。
圖4 杏鮑菇谷蛋白DSC掃描圖Fig.4 DSC scan of glutenin in Pleurotus eryngii
由圖4可知,谷蛋白的變性溫度為73.59℃。不同結構的蛋白質對溫度的敏感性不同,在加工過程中,溫度的控制及其重要。
2.1.6 氨基酸分析
杏鮑菇谷蛋白氨基酸組成成分見表3。
表3 杏鮑菇谷蛋白氨基酸組成成分Table 3 Amino acid composition list of Pleurotus eryngii glutenin
由表3可知,杏鮑菇谷蛋白中含人體所需的必需氨基酸有纈氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸,總含量為40.77%,屬于優質蛋白質。杏鮑菇谷蛋白中酸性氨基酸的含量占總氨基酸含量的21.07%,分別為:天門冬氨酸、谷氨酸。堿性氨基酸含量占總氨基酸含量的13.75%,分別為:精氨酸、賴氨酸、組氨酸。在中性溶液中,酸性氨基酸帶負電,呈酸性,堿性氨基酸帶正電,呈堿性。由此可知,谷蛋白中性溶液呈酸性。支鏈氨基酸是理想的運動補充劑,它通過特殊的方式促進代謝,其中谷蛋白支鏈氨基酸占總氨基酸組分的23.44%,是較好的運動補充劑。芳香族氨基酸能促進多肽鏈中蛋白質分子間的相互作用[13],杏鮑菇清蛋白所測得的芳香氨基酸占總氨基酸組分的18.56%。
2.2.1 離子強度對杏鮑菇谷蛋白功能性質的影響
離子強度對杏鮑菇谷蛋白功能性質的影響見圖5。
圖5 離子強度對谷蛋白功能性質的影響Fig.5 Effects of ionic strength on the functional properties of Pleurotus eryngii glutenin
由圖5中可見,隨著離子強度的增大,持水性呈下降趨勢;持油性、起泡性、起泡穩定性及乳化性呈先降低后增加的趨勢,在離子強度為0.8 g/100 mL時持油性最差,在離子濃度為0.4 g/100 mL時起泡性、起泡穩定性及乳化性最差;溶解性及乳化穩定性呈先上升后下降的趨勢,離子強度為0.6 g/100 mL時溶解性和乳化穩定性最好。
2.2.2 溫度對杏鮑菇谷蛋白功能性質的影響
溫度對杏鮑菇谷蛋白功能性質的影響見圖6。
圖6 溫度對谷蛋白功能性質的影響Fig.6 Effects of temperture on the functional properties of Pleurotus eryngii glutenin
由圖6中可知,在測定溫度的范圍內,除持油性外,溶解性、持水性、起泡性、起泡穩定性、乳化性和乳化穩定性均先增大后減小,在40℃時起泡性和乳化穩定性最好,在50℃時溶解度、持水性及乳化性最好,持油性呈先減小后增大的趨勢,在60℃時最差。
2.2.3 pH值對杏鮑菇谷蛋白功能性質的影響
pH值對杏鮑菇谷蛋白功能性質的影響見圖7。
圖7 pH值對谷蛋白功能性質的影響Fig.7 Effects of pH on the functional properties of Pleurotus eryngii glutenin
圖7可見,pH值在4.5時,杏鮑菇谷蛋白的溶解性、持水性、持油性、起泡性和乳化性均為最小值。在等電點兩側呈上升趨勢,可溶性蛋白才會有泡沫的形成。當pH值大于或小于等電點時,蛋白質溶液中的帶電離子電荷量不同,增加了其在水中的溶解度,同時提高了起泡性。當pH值為4.5時,蛋白液中帶電荷離子相等,使得乳化能力處于最低水平。當溶液的pH值不在等電點時,使得蛋白質更容易溶于溶劑,增加了溶解度,這時更有利于蛋白質分子參與乳化作用[14]。乳化作用的增強使得油與水之間更易形成帶有電荷的薄膜,這樣可以抑制蛋白質形成顆?;驂K狀物質,乳化性隨之提高[15]。泡沫穩定性在等電點附近時升高,可能是因為蛋白質缺乏靜電排斥作用,從而使得泡沫穩定性得以升高[16-18]。
2.2.4 蔗糖濃度對杏鮑菇谷蛋白功能性質的影響
蔗糖濃度對杏鮑菇谷蛋白功能性質的影響見圖8。
圖8 蔗糖對谷蛋白功能性質的影響Fig.8 Effects of sugar on the functional properties of Pleurotus eryngii glutenin
由圖8可見,隨著蔗糖濃度的增大,杏鮑菇谷蛋白的溶解性、持水性、持油性、起泡性和乳化性呈先增大后減少的趨勢,當蔗糖濃度為0.4%、0.6%、0.2%、0.6%、0.6%時分別達到最大值,起泡穩定性和乳化穩定性的變化趨勢則與之相反;在蔗糖濃度為0.6%時,穩定性都最差。這可能是由于蔗糖濃度的增大導致溶液體系的粘稠度增加,此時減小了蛋白質分子的運動,不易于蛋白質在界面的展開[19],因此在高速攪拌時減小了蛋白質產生泡沫的能力,使蛋白質的起泡性下降。
杏鮑菇粉中的谷蛋白的等電點為4.3,其亞基分子量分布在小分子范圍內,易于被人體吸收,在蛋白質中巰基與二硫鍵可以通過氧化還原進行互相轉化,總巰基、游離巰基、二硫鍵含量分別為67.06、28.90、14.35 μmol/g,二級結構占比為 α-螺旋 31.41%、β-折疊55.15%、β-轉角13.45%,變性溫度為73.59℃,含有人體所必需的氨基酸,屬于優質蛋白質。離子強度、溫度、pH值和蔗糖濃度對杏鮑菇谷蛋白的功能特性均有一定的影響。本研究結果可以為杏鮑菇谷蛋白在食品加工中的應用提供理論依據。