豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染的PCR 診斷

蘇述色日

（四川省金陽縣動物衛生監督所 四川涼山610025）

豬 瘟（Classical swine fever，CSF）和豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）的致病原分別為豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），兩種疾病對養豬業都危害巨大。2018 年10 月某豬場發生了一起臨床主要表現為發熱、呼吸困難、全身出血及淋巴結腫大的疫病，通過臨床癥狀初步判斷為CSFV 或PRRSV 感染，為對病例進行確診，筆者對其進行了PCR 診斷。

1 材料與方法

1.1 臨床病料樣品的采集與處理

無菌采集病死豬的淋巴結、腎臟、脾臟等病變組織，將其溶解于5 倍體積生理鹽水中，經搗碎、碾磨、離心后，取上清液，-20℃保存備用。

1.2 引物設計與合成

參照馬萍等[1]建立的CSFV 野毒株與疫苗株鑒別檢測方法設計合成1 對CSFV 野毒株特異性檢測引物（上游引物：5'-AGATTCCAGTGGTGAGAGGGGTA-3'； 下 游 引 物：5'-GCCGGCGCTAAATAAATAAAAAAT-3'），該引物可對CSFV野毒株擴增出641bp的特異性片段，而對CSFV疫苗株無擴增產物。參照曾繁文等[2]建立的PRRSV 不同毒株鑒別檢測方法設計合成1對特異性檢測引物（上游引物：5'-ATGAGTCTTCTACCCGAGG-3'；下游引物：5'-TCAGAGGTGACAGGATTG-3'），該引物可對PRRSV 的經典毒株、高致病性毒株、疫苗株分別擴增出1020bp、933bp、662bp 的特異性片段。

1.3 病毒基因組RNA 的提取與cDNA 的合成

利用病毒基因組RNA 提取試劑盒提取處理后的臨床病料樣品的基因組RNA，以RNA 為模板進行cDNA 合成。cDNA 合成的反應體系為：RNA 9μL、隨機引物1μL、5×Buffer 4μL、dNTP 4μL、M-MLV 逆轉錄酶1μL、RNA 酶抑制劑1μL。cDNA 合成的反應程序為：42℃ 50min，72℃ 10min，4℃終止反應。

1.4 PCR 擴增

以合成的cDNA 為模板，分別按照馬萍等[1]和曾繁文等[2]的PCR 擴增方法進行PCR 擴增，PCR 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

2 結果與分析

如圖1 所示，臨床病料樣品經CSFV 鑒別引物可擴增出641bp 左右的特異性片段，大小與馬萍等[1]報道的CSFV 野毒株片段大小一致。如圖2 所示，臨床病料樣品經PRRSV 鑒別引物可擴增出933bp 左右的特異性片段，大小與曾繁文等[2]報道的PRRSV 高致病性毒株片段大小一致。上述結果表明臨床病料樣品經PCR 檢測為CSFV 和PRRSV 陽性，該臨床病例發生了CSFV 和PRRSV 的混合感染。

圖1 CSFV PCR 擴增結果

圖2 PRRSV PCR 擴增結果

3 討論

CSF 和PRRS 都是豬易感的病毒性傳染病，兩種疾病混合感染大大提高了檢測難度，且臨床中兩種疾病引起的臨床表現極其相似，確診需借助實驗室檢測方法，PCR 檢測方法具有敏感性高、特異性好等優點，是目前疾病診斷最簡單、最準確可靠的檢測方法，在基層動物疾病檢測中得到了廣泛應用。鑒于此，本研究采用PCR 方法對病例進行了確診，為豬場后期及時采取預防和治療措施提供了保障。對于CSFV 和PRRSV 的防控都以疫苗免疫為主，在疫苗接種時要注意免疫途徑和免疫劑量，防止發生免疫失敗。同時加強豬場的飼養管理，堅持自繁自養和全進全出制，保持畜舍環境清新，定期通風換氣，減少各種不利應激因素影響，逐步達到防止疾病暴發和流行的目的。█