噬菌體展示隨機環八肽庫的構建

葉長爛,周 霞,謝浩然,馬金魁，張宏斌

(南部戰區總醫院醫學實驗科,廣東廣州 510010)

噬菌體展示技術 (PDT)于上世紀八十年代末提出并建立，以噬菌體或噬菌粒為載體，是重組蛋白、單鏈抗體、酶、脂蛋白及短肽的一種表達系統[1]。由此衍生的多種噬菌體展示文庫，已廣泛用于研究蛋白質之間或蛋白與非蛋白、生物分子與其他物質之間的相互作用，結合物或模擬表位篩選等[2-7]。然而，應用噬菌體展示庫篩選獲得的靶分子結合物，其親和力等生物活性均較天然配體低。構建并篩選次級噬菌體庫即突變庫是將初篩序列變為理想序列的有效途徑之一。突變文庫是對初次篩選所獲序列中的某些位點或片段(特異或隨機位點)在DNA水平上進行突變，再以噬菌體或噬菌粒為載體構建次級文庫以獲得更高親和力的序列。多肽因具有易制備、便于改造、免疫原性低等優點，在藥物篩選和治療上的重要性越來越受到研究者的重視。多肽根據肽鍵的結構分為直鏈肽和環肽，其中直鏈肽的研究最為廣泛和深入，常用的噬菌體隨機肽庫中插入的基因經噬菌體表達后往往也是以線性直鏈肽的形式展示在噬菌體表面，但直鏈肽進入體內后容易在各類酶的作用下發生快速降解，而經過調整后的環肽在二硫鍵或其他結合鍵的作用下會形成固定構象，不但代謝穩定性和生物利用度會極大提高，而且更符合受體-配體(抗體-抗原)構象的結合要求。

噬菌體展示隨機肽庫因其構建、改造及篩選的易操作優勢使其最受關注。其中以隨機七肽、十二肽和環七肽庫的應用最為廣泛[8-11]。隨機線性七肽、十二肽肽庫結構簡單，適合模擬表位的篩選。隨機環七肽庫，具有環行結構可用于結合域篩選，但受到多樣性和環形結構大小的限制，由于目標結合域的不同，特別是尿酸和農藥類分子，目前的商品化噬菌體展示隨機肽庫無法滿足很多研究的需求?；诖嗽?，本研究構建了噬菌體展示非天然隨機環八肽庫以滿足不同分子，特別是小分子結合物篩選的需要。

1 材料與方法

1.1 材料 Ph.D.Peptide Display Cloning System、大腸桿菌ER2738、EagⅠ-HF和KpnⅠ-HF限制性內切酶為美國NEB公司產品；四環素為SIGMA公司產品；T4連接酶、質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、聚合酶鏈反應(PCR)產物純化試劑盒、Taq DNA聚合酶等為德國QIAGEN公司產品；隨機八肽寡核苷酸引物由上海生工生物技術服務有限公司合成；其他生化試劑均為國產分析純。

1.2 隨機八肽寡核苷酸引物的合成 編碼隨機八肽核苷酸片段的設計策略是采用(NNK)8編碼方式，其中編碼隨機八肽核苷酸序列中密碼子的前兩個核苷酸為任意核苷酸N(A 或 T or C 或 G)，最后一個核苷酸根據密碼子的簡并性設計為K(T 或 G)，K對應的反義鏈配對核苷酸為M(A 或 C)。編碼正鏈序列：5′-GCT TGT (NNK)8 TGC GGT GGA GGT-3′；對應肽鏈：Ala Cys (Xxx)8 Cys Gly Gly Gly。根據載體及EagⅠ和KpnⅠ限制性內切酶酶切位點序列在引物中帶入相應的核苷酸序列，延伸引物采用通用的序列。其中延伸引物序列(S)：5′-CAT GCC CGG GTA CCT TTC TAT TCT C-3′；編碼隨機八肽的寡核苷酸序列(AS)：3′-GG GCC CAT GGA AAG ATA AGA GTG AGA CGA ACA (NNM)8 ACG CCA CCT CCA AGC CGG CTT TGT AC-5′，其中陰影標注堿基分別為KpnⅠ和EagⅠ酶切位點；測序引物序列：3′-GCA ATG CGA TTG ATA CTC CC-5′。

1.3 環八肽庫DNA片段的聚合和酶切 將5 μg合成的編碼環八肽庫的寡核苷酸模板與等摩爾的通用延伸引物在50 μL 含有100 mmol/L NaCl的Tris-EDTA緩沖液(TE)中混合，95 ℃水浴中熱變性1 min，水浴中自然降溫至37 ℃以下形成退火混合物，按反應體系1：水119 μL、10×緩沖液2 20 μL、退火混合物50 μL、10 mmol/L dNTPs 8 μL、Klenow酶3 μL，總體積200 μL，混勻后瞬時離心，37 ℃ 10 min，65 ℃ 15 min延伸退火產物合成編碼環八肽庫的雙鏈DNA片段。隨后，將合成的雙鏈DNA按照反應體系2進行雙酶切：水154 μL、延伸合成的雙鏈DNA196 μL，10×緩沖液4 40 μL、10 U/μL 的EagⅠ-HF和KpnⅠ-HF限制性內切酶各5 μL，總體積400 μL，混勻后瞬時離心，37 ℃ 5 h進行雙酶切，酶切產物瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶，瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化酶切產物。

1.4 載體的酶切與純化 將10 μg載體M13KE加水至196 μL取代反應體系2中的雙鏈DNA，按照反應體系3進行雙酶切:水144 μL、載體M13KE 196 μL，10×緩沖液4 40 μL、10 U/μL 的EagⅠ-HF和KpnⅠ-HF限制性內切酶各10 μL，總體積400 μL，混勻后瞬時離心，37 ℃ 5 h進行雙酶切，酶切產物瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶，瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化酶切產物。

1.5 甘油法感受態細胞的制備 挑ER2738新涂的四環素抗性平板(LB/Tet)單克隆接種于10 mL LB培養液中，37 ℃ 250 r/min搖床培養過夜，按1∶100的比例擴大培養，37 ℃ 250 r/min搖床培養至對數生長期(A6000.5～1.0)。冰浴30 min，4 ℃ 5 000×g離心15 min，棄上清，重懸于預冷的無菌水中，同樣離心棄上清，重復一次重懸于預冷的無菌水中離心棄上清。重懸于10%的預冷無菌甘油的水溶液中，4 ℃ 8 000×g離心10 min棄干凈上清，重懸于10% 冰預冷的甘油溶液。每管100 μL分裝，-80 ℃保存待用。

1.6 連接與轉化 雙酶切載體分別按摩爾比例1∶3、1∶5、1∶10與雙酶切的環八肽庫DNA片段進行小量連接轉化。連接反應按照反應體系4:雙酶切載體M13KE 100 ng、雙酶切肽庫DNA (分別3、5、10 ng)、10×連接緩沖液 2 μL、T4連接酶1 μL、補加水至總體積20 μL，混勻后瞬時離心，16 ℃水浴中孵育過夜進行連接。65 ℃ 15 min熱終止連接反應。取各連接反應產物各1、 2、3 μL分別加至100 μL分裝的電轉化細胞中電轉(Bio-Rad Gene-Pulser： 25 μF，200 Ω，2.5 kV)，立即各加入1 mL SOC培養液，37 ℃ 150 r/min搖床培養30 min。融化每管3 mL分裝的頂層瓊脂糖于45 ℃水浴中保溫，每管加入200 μL對數生長期的ER2738菌作為測試管，分別按1∶10、1∶100、1∶1 000倍比稀釋電轉化培養物，分別取10 μL各稀釋物加至的含頂層瓊脂糖和ER2738的測試管中，混勻后分別鋪于LB/IPTG/Xgal培養板，待頂層瓊脂糖凝固后，37 ℃倒置培養過夜。進行藍斑計數計算滴度。根據結果，確定最佳連接比例為1∶5，連接產物用量2 μL。

1.7 隨機環八肽庫的構建和鑒定 根據確定的最佳比例，2.5 μg雙酶切載體按照反應體系4擴大連接反應，連接反應后純化連接產物，分別取2 μL純化連接產物加至100 μL電轉化細胞中電轉，同時做25個電轉化，立即各加入1 mL SOC培養液，37 ℃ 150 r/min搖床培養30 min。合并各管，混勻留取20 μL進行藍斑計數計算滴度，其余轉化產物進行擴增培養。從測滴度平板上隨機挑取40個單菌落，送測序公司測序，鑒定隨機環八肽庫的多樣性。

1.8 隨機環八肽庫的收獲 將電轉化培養物按1∶50擴大加至對數生長早期(A600<0.5)的ER2738菌中，37 ℃ 250 r/min搖床培養5 h。4 ℃ 5 000×g離心20 min收集上清，加入1/6體積的PEG/NaCl 4 ℃過夜沉淀噬菌體。4 ℃ 5 000×g離心20 min棄上清，沉淀重懸于Tris 鹽緩沖液(TBS)，4 ℃ 5 000×g離心10 min去除殘余細胞，上清加入1/6體積的PEG/NaCl 4 ℃沉淀噬菌體，同法離心棄上清，沉淀重懸于TBS，加入等體積無菌甘油-20 ℃長期保存。

1.9 隨機環八肽庫庫容量的檢測 取2 μL收獲的隨機環八肽庫，按10倍比梯度稀釋，分別取105～109倍比稀釋物各10 μL加至45 ℃水浴中保溫的含頂層瓊脂糖和ER2738的測試管中，混勻后分別鋪于LB/IPTG/Xgal培養板，待頂層瓊脂糖凝固后，37 ℃倒置培養過夜。進行藍斑計數，依據藍斑數和稀釋倍數計算庫容量。

2 結 果

2.1 肽庫的多樣性 肽庫的多樣性受插入目的序列的重組陽性率和插入目的序列的不同率兩個因素的影響。選取40個重組克隆進行序列測定分析，部分結果見圖1，其中重組陽性率為92.5%(37/40)，除去3個為無正確片段插入；插入序列不同率達97.3%(36/37)，除去插入序列有1個為重復序列。重組陽性克隆插入的核苷酸序列堿基數目及其對應的氨基酸均正確，且編碼隨機八肽的DNA序列及對應的氨基酸均互不相同，部分插入序列及對應隨機八肽如下：GGG GCG GGT TCT TCG TAT CCG TAT(G A G S S Y P Y)；GGG ACT ACG TGG CTG TCT CCG AGT(G T T W L S P S)；CAG GTG CCG GCT CTG AAT CCG TCG(Q V P A L N P S)；ACG TTG GGT CAG ACG ATT CAT ATG(T L G Q T I H M)；TTG TTG CAT TCT AAT AAT CTG TCG(L L H S N N L S)；CGG CCT GAT CAT CCT AGT TTT TCT(R P D H P S F S)。堿基分布情況分析見表1，4種核苷酸的出現情況與預先設計的NNK模式相符，第一、 第二核苷酸分別為A/T/C/G中的任一種，其中每一種核苷酸和出現的頻率的理論值為25%，第三位核苷酸為G/T中的任一種，G或T的出現頻率為50%。由于樣本量的原因實際值與理論值不是完全一致。

2.2 庫容量 LB/IPTG/Xgal培養板進行噬菌體滴度測量的原理是每個噬菌斑代表1個噬菌體，白斑代表是野生噬菌體，藍斑代表是重組噬菌體。依據庫容檢測平板上的藍色噬菌斑數約7.5×109(即庫容量)，結合重組的陽性率92.5%和插入序列的不同率97.3%。參照計算公式：實際庫容量=平板總藍色噬菌斑數×重組陽性率×序列的不同率，確定所構建的隨機環八肽庫的庫容量，其實際庫容量(多樣性)為6.75×109克隆。結果表明，所構建的噬菌體呈現隨機環八肽庫的框架結構、庫容及多樣性符合設計要求。

圖1 肽庫挑克隆測序部分結果

編碼位置ATGC125.030.020.025.0222.522.525.030.030.052.547.50.0

3 討 論

多肽的長短和構象決定構建的肽庫的應用價值，曾有學者設想構建15～100個氨基酸殘基片段的肽庫，以期肽鏈中自然形成含有天然表位中的一些二級結構。但由于噬菌體展示肽庫的構建過程中需要DNA轉化，目前最有效的電轉化率也很難超過1010，而且對于多樣性超過1012的肽庫，由于重復拷貝太低很難從中富集到需要的隨機肽段。因此，構建噬菌體展示隨機肽庫研究的重點從追求延長氨基酸殘基片段的長度逐步轉向了設計隨機氨基酸殘基序列，人為讓其形成具有二硫鍵的環狀結構即噬菌體展示環肽庫。因此，噬菌體展示環肽庫的構建及應用也隨之更受研究者的偏重，而且噬菌體展示環肽庫在模擬物的篩選及在檢測和診斷方面的應用已取得了很多進展[12-15]。

目前應用最廣泛的環肽庫是商品化的噬菌體展示環七肽庫，但由于受環狀結構大小和庫容的限制不能滿足多種篩選的需要。本研究在前期商品化隨機七肽、十二肽和的環七肽庫篩選的基礎上，基于尿酸等小分子化合物的特點構建了噬菌體展示隨機環八肽庫，增加了庫容的多樣性和肽環的大小。另外，本研究所選用的載體M13KE來源于M13mp19，僅包含一個gⅢ的單拷貝，更適合發現高親和力的配體。同時與以前所用的噬菌粒載體不同，其不需要抗菌藥物篩選和輔助噬菌體超感染。

本項目所構建的噬菌體展示隨機環八肽庫和目前商品化肽庫具有不同的氨基酸序列和環狀結合域，不但可為尿酸等醫學相關小分子化合物的結合物篩選提供一種新的選擇，而且可能更適合某些分子的結合，這些將有望在相關分子的臨床檢測和治療研究中有所突破。同時，所構建的噬菌體展示隨機環八肽庫可彌補目前商品化市場的不足，為今后開展肽庫的相關研究與應用，特別是多肽類藥物和檢測試劑的篩選奠定了基礎。

4 結 論

本研究針對小分子化合物的特點，采用人工合成的方法成功構建了庫容量與多樣性都滿足篩選要求的噬菌體展示非天然隨機環八肽庫，并有望為多肽類制劑篩選的研究提供一種新的選擇。