高壓靜電場技術制作藻酸鈣載藥微球及其性能研究

王宗鑫 張永軍 陳維明 徐勇 周廣東

藥物緩釋系統能更好地保持藥物活性，延長藥物有效作用時間，使藥物緩慢、規律地釋放，減少了大劑量多頻次用藥造成的副作用，用藥更加便捷安全[1]。藻酸鈣凝膠是目前藥物緩釋研究的熱點之一，是由藻酸鈉溶液與Ca2+反應形成的單網絡水凝膠，有較好的生物相容性，可負載細胞或藥物[2]。因具有較好的可塑性，藻酸鈣凝膠被用作藥物緩釋系統時，多被制作成微球。然而，目前制作藻酸鈣微球采用乳化方法，有機溶劑易破壞藥物的活性并存在溶劑殘留風險[3-4]。另外，藻酸鈣微球直徑較大，且大小不均勻，嚴重阻礙了這種藥物緩釋系統的臨床應用。高壓靜電場技術通過高壓靜電使針頭內的液體帶電，由于靜電斥力使液滴分裂成細小的微滴，接觸Ca2+后被交聯成微球，高效、可控、簡便[5]。本研究嘗試采用高壓靜電場技術，從電壓、藻酸鈉濃度、CaCl2濃度、離心轉速和針頭直徑等5個方面，探索最佳參數組合，并采用牛血清白蛋白（BSA）為模型藥物，探索這類微球的體外緩釋行為。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

無水CaCl2（美國Sigma），藻酸鈉 （分子量67 KD，美國 Sigma），磷酸鹽緩沖溶液（PBS，美國 Sigma）,牛血清白蛋白（BSA，純度＞98%，上海阿拉?。?，BCA微量蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天），直流高壓發生器（美國Spellman），10 ml注射器（上?？档氯R），磁力攪拌器（德國IKA），場發射掃描電子顯微鏡JEOL-6380LV（日本電子株式會社），光學顯微鏡（日本 Nikon），恒溫搖床（德國 IKA），酶標儀（美國 Thermo）。

1.2 藻酸鈣載藥微球的制備

取一定質量的藻酸鈉粉末加入去離子水中，置于50℃水浴中攪拌，徹底溶解，靜置過夜去除氣泡后用注射器抽取，將針頭與高壓直流電源連接；另將CaCl2溶液放置于磁力攪拌器上，接收距離10 cm，打開電源，液滴受到重力和電勢差驅動力形成射流，進入CaCl2溶液，形成載藥微球。繼續交聯30 min后，去離子水洗去表面的CaCl2溶液（圖1）。

圖1 藻酸鈣微球制作模式圖Fig.1 Pattern diagram of calcium alginate microspheres

1.3 微球直徑和表面形態觀察

隨機選取約100粒微球，40倍視野下用光學顯微鏡拍照，使用Image J軟件進行微球直徑測量。微球凍干后，隨機取約100粒微球黏附于電鏡載物臺上，抽取真空，噴金后觀察微球表面形態。

1.4 最佳電壓

我們綜合大量已有的制作參數，采用1 M CaCl2、1%藻酸鈉、200 r/min和30 G針頭。電壓分別采用2 KV、10 KV和16 KV。篩選最佳電壓方法：使用光學顯微鏡和電鏡對微球直徑和表面形態進行觀察。篩選標準：直徑最小，標準差最小，形態規整。

1.5 最佳藻酸鈉濃度

在 16 KV、1 M CaCl2、200 r/min、30 G 針頭基礎上，分別測試0.5%、1%、1.5%藻酸鈉，篩選方法和標準同1.3。

1.6 最佳CaCl2濃度

在 16 KV、0.5%藻酸鈉、200 r/min、30 G 針頭基礎上，分別測試 0.5 M、1 M、1.5 M CaCl2，篩選方法和標準同1.3。

1.7 離心機最佳轉速

在 16 KV、1 M CaCl2、0.5%藻酸鈉、30 G 針頭基礎上，分別測試 200 r/min、600 r/min、1 000 r/min，篩選方法和標準同1.3。

1.8 最佳針頭大小

在 16 KV、1 M CaCl2、0.5%藻酸鈉、200 r/min 基礎上，分別測試27 G、30 G、32 G針頭，篩選方法和標準同1.3。

1.9 3種載藥微球的藥物包封率和載藥率

采用最佳參數組合，制作1%、3%、5%BSA濃度的藻酸鈉BSA混合液，分別設為L組、M組和H組。微球制作完畢后，收集燒杯內剩余液體和微球洗滌液，使用BCA微量蛋白濃度測定試劑盒測定其未包封的BSA含量（最大吸收峰在280 nm），同時用微量天平秤量微球總重量。包封率=（BSA總量-未包封BSA含量）/BSA總量×100%，載藥率=（BSA總量-未包封BSA 含量）/微球總重量×100%[6]。

1.10 3種載藥微球的體外釋放實驗

各組分別秤取100 mg的載藥微球，放入15 mL離心管中，加入10 mL PBS液（pH 7.4），擰緊蓋子，將其置于37℃恒溫搖床上，轉速100 r/min，分別在第 2、4、8、24小時和第 3、7、14、28 天離心后，吸走全部緩釋液，添加10 mL新鮮PBS液。以BCA微量蛋白濃度測定試劑盒測定緩釋液中BSA含量，即此時間段微球藥物釋放量。累積釋放量=BSA釋放量/微球中BSA總量×100%。

1.11 統計學分析

使用 SAS 9.4（SAS Institute Inc.，美國）統計學軟件，所有計量數據以（±s）表示，對各組間的數據比較使用Student-Newman-Keuls法或Dunnett法行方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 微球形態學觀察

當電壓為16 KV，藻酸鈉濃度為0.5%，氯化鈣濃度為1 M，轉速為200 r/min，針頭為30 G時，成球效果較好，具有較小的平均直徑且大小均一。使用其他參數時，有時雖能成球形，但平均直徑大，或大小不均一，或形狀不規則（甚至不能成球形）。根據制作載藥微球的原則，考慮選取電壓16 KV、藻酸鈉濃度0.5%、氯化鈣濃度 1 M、轉速 200 r/min、針頭 30 G，作為最佳參數組合來制備微球。掃描電鏡結果與光鏡結果一致，微球凍干后形態雖有變化，但大小較均勻，適合下一步制作載藥微球（圖2～6）。

圖2 不同電壓組的微球形態Fig.2 Morphology of microspheres in different voltage groups

圖3 不同藻酸鈉濃度組的微球形態Fig.3 Morphology of microspheres in different alginate concentration groups

圖4 不同CaCl2濃度組的微球形態Fig.4 Morphology of microspheres in different CaCl2 concentration groups

圖5 不同轉速下的微球形態Fig.5 Morphology of microspheres at different rotational speeds

圖6 不同型號針頭下的微球形態Fig.6 Microsphere morphology under different types of needles

2.2 載藥微球包封率及載藥率

BSA標準曲線的線性回歸方程為：Y=1.5038X+0.1095，R2=0.9981（圖 7）。 以此線性方程為基礎，計算得到L、M、H組微球的包封率分別為 （91±1.46）%、（85±1.63）%、（79±3.29）%，載藥率分別為（0.89±0.04）%、（2.56±0.57）%、（4.10±1.21）%?？梢婋S著初始給藥量的增加，包封率逐漸減小，載藥率逐漸增加。

圖7 BSA溶液的標準曲線Fig.7 Standard curve of BSA solution

2.3 載藥微球體外釋藥

不同載藥濃度微球的粒徑分析，加藥后3組微球的直徑沒有明顯變化，在一定載藥濃度范圍下，藥物不會影響微球的直徑。藥物累計釋放率檢測顯示，使用最佳參數組合制備出的3組微球緩釋持續時間較長（＞28 d），并都具有典型的三相釋放規律。載藥微球放入PBS釋放介質后的24 h內，藥物釋放速度較快，3組累積釋放率在25%～40%之間，24 h后釋藥曲線逐漸變緩，后期釋放逐漸加速。另外，隨著載藥量的增加，各時間點的釋放速率也在增加，因此可以根據載藥量調節釋放速率（圖8）。

圖8 各組BSA-藻酸鈣微球粒徑分析及體外緩釋曲線Fig.8 Particle diameter analysis and sustained release curve of BSA-calcium alginate in each group

3 討論

藻酸鈉是從藻類植物中提取的一種天然生物活性大分子，來源廣泛，降解產物為CO2、H2O和Na+，生物安全性高，被廣泛應用于食品和藥品行業[7]。藻酸鹽敷料被美國FDA批準應用于皮膚創面的修復[8]。藻酸鈉分子由G單元和M單元組成，其中的Na+可以與某些金屬離子進行交換，后者可與G單元交聯形成“蛋盒結構”，由溶液向凝膠轉變[4]。金屬離子（如 Cu2+、Pb2+、Co2+和 Mn2+）可作為交聯劑，但具有一定的毒性，Ca2+的生物相容性更高，一般使用CaCl2作為交聯溶液[2，8]。藻酸鈣凝膠也具有很高的生物相容性，在組織工程領域被用于干細胞或終末細胞的3D培養，可以較好地促進干細胞分化，保持終末細胞的表型[2]。藻酸鈣微球緩釋體系制作方便，藥物包封率高，與用人工合成化合物制作的微球（如PLGA微球）相比，生物相容性更佳，具有很好的應用前景。制作藻酸鈣微球一般采用乳化方法，多采用二氯甲烷等有機溶劑作為油相，可能破壞藥物的活性，且存在溶劑殘留的風險。我們采用高壓靜電場技術制作微球，制作過程不使用有機溶劑，更加安全。

目前該技術制備的載藥微球直徑較大且形狀不均勻，還未探索出最佳參數組合，微球緩釋行為也未深入研究，故本研究擬探索制備的最佳參數組合，以制備出直徑更小更均勻的微球，并在此基礎上研究載藥后的緩釋行為。

高壓靜電場技術需使用4個裝置，即高壓電源、注射器、微球接收容器和磁力攪拌器[5]。高壓電源與注射器針頭連接使針頭內的藻酸鈉液體帶電，接收容器內液體與針頭之間的電勢差是驅動射流的動力。藻酸鈉液體帶電后由于靜電斥力液滴分裂成微小液滴，集聚成高速射流進入Ca2+溶液被交聯固化[9]。磁力攪拌器的適當攪拌可使藻酸鈣液滴被快速、充分地交聯，并避免局部凝膠微球的聚集。

藻酸鈣微球的直徑大小與電壓、CaCl2濃度、藻酸鈉濃度，以及磁力攪拌器的轉速和針頭直徑等因素有關。以往的研究未綜合考慮這5個參數的有機整合。我們首先綜合了其他既有研究的參數，設置合理的藻酸鈉濃度、CaCl2濃度，以及轉速和針頭規格，探索電壓對直徑大小的影響。隨著電壓的增加（達到16 KV），微球直徑降低，這可能是由于電壓的增加使得液滴的分裂更加充分，液滴更小造成的[5]。藻酸鈉溶液濃度越?。?.5%），黏性越小，在施加電壓后液滴更容易分裂，液滴越小[5，10-11]。CaCl2的濃度越大（1.5 M），雖然制作出的微球平均直徑變小，但是大小不一，標準差變大，不宜采用。平均直徑變小是因為CaCl2的濃度越大，導電性越高，針頭與CaCl2液體之間的電勢差就越大，加載到針頭上的電壓相對變大[10]。標準差變大的原因可能是CaCl2的濃度越大，液滴更快地被交聯固化，液體剪切力打散部分微滴，一部分未打散。1 M CaCl2濃度制作出的微球大小適中，形態規整，可采用。轉速越大（1 000 r/min），液體剪切力越大，會使形成的微球撕裂變形，因此轉速不宜過大，200 r/min較為合適。由于藻酸鹽黏度較大，針頭直徑過?。?7 G），液體不易流出，影響了液滴的分裂，針頭直徑過大（32 G），液體流出過快，不能充分分裂，所以30 G的針頭比較適合。以上參數組合，制作成的微球比其他文獻報道的直徑更小[5]，釋藥的比表面積更大，藥物釋放更加高效[12]。同時，更容易注射[6]，或與其他凝膠介質混合[7]。微球大小均勻，標準差更小，生產過程中易于質控，實際使用時，劑量更精準。因此，16 KV電壓、1 M CaCl2濃度、0.5%藻酸鈉濃度、200 r/min和30 G的針頭是最佳參數組合。

我們對藻酸鈣微球的緩釋行為的研究采用了BSA作為模型藥物，設置了低、中、高3個藥物濃度，研究了藥物包封率、載藥率和體外緩釋規律。3組的藥物包封率都很高，說明該方法制作的藻酸鈣微球有很好的藥物包封能力，可有效阻止微球制備過程中藥物向外部的滲漏，減少藥物浪費。結果表明，初始給藥量越少，緩釋載體（藻酸鈣凝膠）和藥物的比例就越高，緩釋載體就把藥物包封得更加充分，從而獲得更高的包封率，但載藥率相應減少[11]。3組藥物濃度的緩釋微球都能夠保持較長的藥物釋放時間（至少28 d），緩釋效果明顯。原因可能是：藻酸鹽分子中只有G單元被Ca2+交聯，所以本研究采用G/M比值高的藻酸鈉作為原料，交聯程度更高，降解更慢，藥物包封更加充分，所以緩釋時間更長[4，8]。

通過分析3組的體外累計緩釋曲線（pH 7.4）可見：3組曲線都分為3個階段，即突釋期、緩慢釋放區和加速釋放區[6]；另外，載藥濃度越高，各階段的累計釋放比例越高。微球緩釋系統中藥物釋放的主要機制為：突釋、擴散和降解[1]。突釋現象的產生是因為黏附在微球表面及臨近表面的藥物，在短期內快速溶解造成的[13]。然而，藻酸鈣微球突釋現象的產生又有著特殊之處，是由于藻酸鹽在CaCl2溶液中被交聯，交聯后為了進一步增加機械性能，浸泡了一段時間，而后用水洗去了微球表面的CaCl2溶液，這一系列操作會造成微球表面黏附的藥物大部分損失，因此在研究緩釋行為時，突釋的產生主要是臨近微球表面的藥物起主導作用，最外面的藥物很少，起次要作用。載藥量大，表面的藥物顆粒就越多，溶解后留下的通道就越多，溶液更容易進入微球內部，臨近表面的藥物溶解越快，所以載藥量多的分組突釋現象更加明顯[13]。雖然3組都可觀察到突釋現象，但是突釋并不劇烈，即使高載藥組也未超過40%。起始階段釋放一定的藥量可作為基礎藥量，隨著藥物的代謝，后面階段藥物的釋放可以補充藥物的損失，以維持局部有效藥物濃度。

突釋現象后，擴散行為起主要作用，進入慢速緩釋階段。擴散與微粒直徑、溶液進入微球的通道數量、濃度梯度有關。因為3組直徑差別不大，擴散距離基本一致，所以通道數量、濃度梯度起主要作用[13]。如前述，高載藥組的通道數量更多，溶液進入微球內部更多，藥物的溶解擴散更多。另外，高載藥組微球內外的藥物濃度梯度差更大，化學驅動力更高，更容易擴散出來。所以，此階段高載藥組的釋放比例更高。隨著時間的延長，藻酸鈣緩釋支架逐漸降解，內部凝膠網絡崩塌，藥物快速釋出，因此進入快速釋藥階段。本研究所采用的緩釋溶液是在pH 7.4的PBS液中進行的，PBS液中存在著大量金屬離子，會和凝膠中的交聯劑Ca2+進行緩慢的離子交換，藻酸鈣微球支架發生解聚降解。如前所述，高載藥組由于藥物/支架比增加，藻酸鹽比例較少，分解更快，加之溶液進入微球內部的通道更多，水分子和其他金屬離子大量進入加劇了凝膠分子鏈的解聚，包封的藥物大量溶解釋出?？梢?，藻酸鈣微球的直徑、載藥量都可以影響其藥物緩釋行為。我們經過最佳參數組合的摸索，制備出的微球具有較高的包封率，緩釋持續時間較長，并且具有典型的三相釋放規律，是一種良好的藥物緩釋系統。

4 結論

本研究采用高壓靜電場流技術成功制備出藻酸鈣微球，該方法簡便，易于調控參數，無有機溶劑，生物相容性更高。通過光鏡和電鏡觀察微球的形態和直徑，確定了最佳參數組合。本方法制備的微球具有更小的直徑，且更為均勻，形狀規則，性狀穩定。這種微球負載模型藥物BSA時，具有很好的藥物包封率，體外緩釋時間較長，釋放行為穩定、規律。在將來的研究中可以此注射或復合其他生物材料進行藥物緩釋，臨床應用前景廣泛，潛力巨大。