糖化bFGF對HUVEC體外血管化的效應研究

肖嫻 黃瑤 倪鵬文 謝挺

目前,全球3.87億糖尿病患者中，有15%的患者引發足部潰瘍，每20秒就有1例糖尿病下肢潰瘍患者需接受截肢治療[1]。糖尿病導致機體病變主要通過4條途徑：多元醇通路活性增高、晚期糖化終末產物（Advanced glycation end products，AGEs）形成增加、蛋白激酶 C（Protein kinase C，PKC）激活和氨基己糖通路活性增高[2]。文獻表明，AGEs局部蓄積的病理效應導致皮膚微環境的改變，是糖尿病創面難愈的重要因素。在創面修復的諸多環節中，bFGF是維系皮膚組織正常代謝和創面愈合過程的重要成員。bFGF主要來源于包括內皮細胞在內的多種組織細胞，并廣泛分布于人體組織，通過與受體結合，對局部組織細胞增殖、趨化，細胞外基質生成和微血管化有明顯作用[3]。近年來的研究發現，bFGF在慢性潰瘍和增生性瘢痕組織中的表達增多[4]；糖尿病小鼠腦脊液中，可檢測出被顯著糖化的bFGF[5]。這些研究結果提示，bFGF作為一種蛋白質，理論上在糖尿病皮膚組織中是可以被糖化的，生成糖化bFGF。

創面愈合時，血管內皮細胞是皮膚的主要修復細胞之一。創面正常愈合必須依靠足量、有效的血管化，血管內皮細胞通過發揮其增殖和遷移能力，對維護血管完整性、促進血管再生起重要作用。但AGEs的蓄積，抑制了內皮細胞增殖并誘導其凋亡。將葡萄糖與bFGF混合后的基質膠種植模型植入非糖尿病大鼠中，可抑制血管生成和肉芽形成[6]。bFGF糖化后發生功能異常，使其不能發揮正常的促愈效應，可能是創面難愈的重要原因之一。本實驗擬制備糖化bFGF模型，了解bFGF糖化后對其主要效應細胞-血管內皮細胞生物學行為的影響，以期為糖尿病創面愈合中生長因子的相關研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

bFGF（美國 Gibco公司）；CHCA、果糖粉劑、葡萄糖-6-磷酸粉劑（美國Sigma公司）；乙腈、三氟乙酸（德國 Merck 公司）；SyncronisC18 column（美國 Thermo公司）；HUVEC、內皮細胞生長培養基（即用型）、胰蛋白酶/EDTA（0.04%/0.03%）、胰蛋白酶中和溶液（TNS）、無血清凍存液、HEPES緩沖鹽溶液（德國Promocell公司）；CCK-8試劑盒（日本DOJINDO公司）；Matrigel Basement Membrane Matrix（美國Corning公司）；FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）。

Mass Standards Kit for the 5800 Proteomics Analyzer（美國 ABI公司）；5800 MALDI TOF/TOFTM Analyzer（美國 SCIEX 公司）；Ultimate 3000UHPLC（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 bFGF和糖化bFGF的制備

分別用果糖和葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）制備糖化bFGF[7-8]。以下為果糖制備糖化bFGF的方法（同G-6-P制備糖化bFGF方法）。①制備0.25 M果糖溶液。將0.45 g果糖粉劑分別溶解于10 mL PBS中，震蕩混勻，用0.22 μm濾器過濾備用；②制備10 μg/mL bFGF溶液。將1 mg bFGF粉劑溶解于1 mL PBS溶液中，形成1 mg/mL bFGF溶液，取出其中10 μL bFGF溶液加入990 μL PBS溶液中；③取出500 μL 0.25 M 果糖溶液和 500 μL 10 μg/mL bFGF 溶液，將其混合于1.5 mL Eppendorf管中，形成5 μg/ml糖化bFGF溶液，置于37℃、5%CO2培養箱孵育7 d。同時，另外制備5 μg/ml糖化bFGF溶液，置于37℃、5%CO2培養箱孵育48 h；④制備5 μg/mL bFGF溶液。分別取出 500 μL PBS 溶液和 500 μL 10 μg/mL bFGF 溶液，將其混合于1.5 ml Eppendorf管中。

1.2.2 質譜鑒定糖化bFGF體外模型

取制備好的糖化bFGF樣品適量，使用C8StageTip柱進行鹽分洗脫，上樣到色譜柱的蛋白樣品使用0.1%的三氟乙酸（TFA）重復沖洗多次，確保樣品中鹽分被充分洗脫，最后使用80%的乙晴（ACN）和0.1%TFA將蛋白洗脫下來，保存待檢。

取1 μL糖化bFGF樣品，直接點于樣品靶上，讓溶劑自然干燥，再取0.5 μL過飽和的α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）基質溶液（溶劑為 50%ACN，0.1%TFA）點至對應靶位上并自然干燥。樣品靶經氮氣吹凈后放入儀器進靶槽并用5800串聯飛行時間質譜儀進行質譜分析，激光源為355 nm波長的Nd:YAG激光器，加速電壓為2.5 KV，采用正離子模式和自動獲取數據的模式采集數據，質量掃描范圍為800～35 000 Da。

1.2.3 色譜法分析糖化bFGF模型成分

分別取50 μL bFGF溶液和 100 μL糖化 bFGF溶液，濃縮后，用 18 μL A 液（0.1%TFA）復溶后，上樣；進樣量為15 μL；紫外吸收波長254 nm；流動相包括 A 液（0.1%TFA）和 B 液（CAN）液；色譜梯度：總60 min（3～30 min，5%～50%B）。

1.2.4 bFGF和糖化bFGF干預條件的確定

參考文獻[8-10]方法，選擇2～80 ng/mL的濃度梯度來篩選bFGF和糖化bFGF的干預濃度。利用CCK-8方法，觀察兩組OD值，繪制標準曲線。確定干預濃度的標準是：兩組之間OD值差異最為明顯。

配制 80 ng/mL、40 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、4 ng/mL、2 ng/mL的 bFGF和糖化 bFGF （表 1-2）。bFGF和糖化bFGF的初始濃度為5 μg/mL。

表1 2～80 ng/mL bFGF的配制Table 1 Preparation of 2-80 ng/mL bFGF

表2 2～80 ng/mL糖化bFGF的配制Table 2 Preparation of 2-80 ng/mL glycated bFGF

用2～80 ng/ml濃度的bFGF或糖化bFGF干預96孔板中的HUVEC，培養24 h后以CCK-8法測量OD值。

1.2.5 培養HUVEC

預先將HUVEC生長培養基（即用型）10 mL加入培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱30 min；取出細胞株后迅速置于37℃恒溫水浴箱，靜置2 min，吸取細胞懸液至預溫過的培養液中，置于37℃、5%CO2培養箱；待細胞生長至培養瓶面積的70%～90%，即可傳代。傳代時棄去舊培養液，按100 μL/cm2的比例加入HEPE緩沖液，輕柔沖洗細胞15 s后棄去；然后按100 μL/cm2的比例加入EDTA （0.04%/0.03%）溶液，倒置顯微鏡下觀察細胞狀態，待80%細胞變圓后，按100 μL/cm2的比例加入胰蛋白酶中和液TNS；收集細胞懸液，220 g離心4 min，棄去上清液；加入適量內皮細胞生長培養基重懸細胞，轉移至培養瓶，置于37℃、5%CO2培養箱。

1.2.6 CCK-8實驗檢測bFGF和糖化bFGF干預人真皮微血管內皮細胞（HUVEC）后的細胞增殖效應

將指數生長期的HUVEC用胰蛋白酶/EDTA（0.04%/0.03%）消化，按 5×103個/孔的密度接種于96孔板，每組5個副孔，置于37℃、5%CO2培養箱培養；次日，每孔用100 μL PBS溶液洗板。分別用內皮細胞培養基、20 ng/mL bFGF內皮細胞培養基、20 ng/mL糖化bFGF內皮細胞培養基刺激細胞，每孔 100 μL；分別于刺激后 1 d、3 d及 7 d后測定HUVEC的增殖活性。測定前，棄96孔板中舊培養液，每孔用100 μL PBS溶液洗板。將內皮細胞培養基和CCK-8溶液按10∶1的比例混合后，每孔加入100 μL混合液，同時設置空白孔，置于37℃、5%CO2培養箱，于2 h后用酶標儀在450 nm處讀取吸光度值。實驗分成3組：①空白組（0 ng/mL bFGF內皮細胞培養基）；②實驗組（含有20 ng/mL糖化bFGF的內皮細胞培養基）；③對照組（含有20 ng/mL bFGF的內皮細胞培養基）。該實驗重復3次。以空白組第1天OD值均數為基數，其余各時相點（含空白組第3天及第7天、實驗組和對照組所有時相點）OD值除以空白組第1天OD值均數，獲得細胞增殖百分數表示細胞增殖活性。

1.2.7 bFGF和糖化bFGF干預后的HUVEC血管形成能力

將Matrigel Basement Membrane Matrix置于冰盒后放入4℃冰箱過夜，同時將實驗使用的48孔板和Tip頭均置于4℃冰箱預冷；次日，將液化后的Matrigel Basement Membrane Matrix 按 150 μL/孔加入48孔板中，置于37℃、5%CO2培養箱30 min；將指數生長期的HUVEC用胰蛋白酶/EDTA（0.04%/0.03%）消化，待80%細胞變圓，加入胰蛋白酶中和液TNS，以220 g離心4 min，棄上清，加內皮細胞培養基重懸細胞，計數，按2×104個/孔的密度接種于已固化于48孔板的Matrigel Basement Membrane Matrix中，每組3個副孔，同時加入100 μL內皮細胞培養基、40 ng/mL bFGF內皮細胞培養基、40 ng/mL糖化bFGF內皮細胞培養基，形成終濃度為0 ng/mL、20 ng/mL bFGF和20 ng/mL糖化bFGF的刺激液，置于37℃、5%CO2培養箱，6 h后倒置顯微鏡觀察血管樣結構。實驗分成3組：①空白組 （0 ng/mL bFGF內皮細胞培養基）；②實驗組（含20 ng/mL糖化bFGF的內皮細胞培養基）；③對照組（含20 ng/mL bFGF的內皮細胞培養基）。實驗重復3次，結果采用Image J軟件分析，包括節點數量、交叉點數量、網眼數量和主干分段數量。

1.2.8 bFGF和糖化bFGF干預后HUVEC的凋亡

將指數生長期的HUVEC用胰蛋白酶/EDTA（0.04%/0.03%）消化，待80%細胞變圓，加入胰蛋白酶中和液TNS，220 g離心4 min，棄上清，加入內皮細胞培養基，重懸細胞，計數，按1×104個/孔的密度接種于6孔板，每組3個副孔，置于37℃、5%CO2培養箱培養；次日，棄原培養板中的內皮細胞培養基，每孔用1 mL PBS溶液洗板一次。分別用內皮細胞培養基、20 ng/mL bFGF內皮細胞培養基、20 ng/mL糖化bFGF內皮細胞培養基刺激細胞，每孔2 mL；分別于刺激后1 d、3 d、7 d后測定HUVEC的凋亡。測定當日，吸取6孔板中舊培養液至流式管中，每孔用1 mL PBS溶液洗板一次后，加入500 μL無EDTA胰酶，顯微鏡下觀察細胞同時晃動6孔板，待細胞變圓漂起即用原內皮細胞培養基中止消化。輕柔吹打細胞后，將細胞懸液吸至流式管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清并倒扣于濾紙上。將試劑盒中的10×緩沖液用PBS配制成1×工作液，每管加入60 μL工作液重懸細胞，其中空白管加入100 μL工作液用于測定細胞大小及活性。然后除空白管外，每管加入3.8 μL Annexin V試劑，室溫避光10 min后，除空白管外，每管再依次加入3.8 μL PI試劑和100 μL工作液，充分混勻后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗分成3組：①空白組（0 ng/mL bFGF內皮細胞培養基）；②實驗組（含有20 ng/mL糖化bFGF的內皮細胞培養基）；③對照組（含有20 ng/mL bFGF的內皮細胞培養基）。該實驗重復3次。

1.2.9 統計方法

2 結果

2.1 體外糖化bFGF制備

MALDI-TOF-MS分析 bFGF和糖化 bFGF，確定bFGF相對分子量為16 700 Da，而使用G-6-P孵育48 h和7 d的糖化bFGF并未找到相應分子量峰值，使用果糖孵育7 d的糖化bFGF也未找到相應峰值，僅僅發現使用果糖孵育48 h的糖化bFGF的相對分子量呈現為16 992 Da（圖1）。

圖1 bFGF和糖化bFGF的質譜分析圖譜Fig 1 Mass spectrometry of bFGF and glycated bFGF

2.2 糖化bFGF樣品的成分分析

通過MALDI-TOF-MS發現使用果糖孵育48 h的糖化bFGF能找到糖基化峰值，使用此種糖化bFGF實施高效液相色譜法，可看出在6～22 min的梯度區間內，發現多個bFGF差異色譜峰 （同水相比）；在7～22 min的梯度區間內，制備的糖化bFGF樣品與bFGF相比，有著極為相似的差異色譜分；制備的糖化bFGF樣品同H2O和bFGF相比，糖化bFGF在6～7 min之間出現差異色譜峰，且隨樣品濃度的增加，該色譜峰呈現增高的趨勢（圖2）。

圖2 H2O、bFGF、糖化bFGF在高效液相色譜法中的差異色譜峰Fig.2 Chromatographic peaks of H2O,bFGF and glycated bFGF in HPLC

2.3 bFGF和糖化bFGF干預細胞的濃度選擇

繪制標準曲線發現5×103個/孔為最佳濃度。bFGF和糖化bFGF干預24 h后，bFGF總體上似乎表現出更好的促增殖效果，在濃度為20 ng/mL時，測得兩組間的OD值差異最為明顯，故以20 ng/mL作為本實驗的干預濃度（圖3）。

圖3 不同濃度的bFGF和糖化bFGF干預對HUVEC增殖的影響Fig.3 The effect of different concentrations of bFGF and glycated bFGF on the proliferation of HUVEC

2.4 bFGF與糖化bFGF對HUVEC增殖的影響

干預后第1天，對照組較空白組的細胞增殖顯著增高（P＜0.01）；實驗組較空白組的細胞增殖顯著增高（P＜0.05）；對照組較實驗組的細胞增殖顯著增高（P＜0.01）（圖 4）。

干預后第3天，對照組較空白組的細胞增殖顯著增高（P＜0.001）；實驗組與空白組的細胞增殖無顯著差異（P＞0.05）；對照組較實驗組的細胞增殖顯著增高（P＜0.001）（圖 4）。

干預后第7天，對照組較空白組的細胞增殖顯著增高（P＜0.05）；實驗組與空白組的細胞增殖無顯著差異（P＞0.05）；對照組較實驗組的細胞增殖顯著增高（P＜0.001）（圖 4）。

圖4 CCK-8實驗檢測HUVEC增殖效應Fig.4 CCK-8 assay for proliferation effect of HUVEC

2.5 bFGF與糖化bFGF對HUVEC血管形成的影響

Matrigel Basement Membrane Matrix培養條件下，與空白組相比，對照組干預6 h后，可明顯觀察到HUVEC的管樣結構形成增多，其血管形成的節點數量、交叉點數量、網眼數量、主干分段數量都具有顯著統計學差異（P＜0.05）；與空白組相比，實驗組的管樣結構較為稀疏和不完整，血管形成的節點數量、交叉點數量、主干分段數量均顯著減少（P＜0.05），網眼數量與空白組相比無顯著差異（圖5）。

圖5 Matrigel凝膠實驗檢測HUVEC血管形成效應Fig.5 Matrigel gel assay for HUVEC angiogenesis

2.6 bFGF與糖化bFGF對HUVEC凋亡的影響

干預后第1、3天，實驗組與對照組的細胞凋亡無顯著差異（P＞0.05）；干預后第7天，實驗組較對照組的細胞凋亡顯著增高（P＜0.01）（圖 6）。

圖6 流式細胞技術檢測HUVEC凋亡效應Fig.6 Flow cytometry assay for HUVEC apoptosis

3 討論

我們選擇0.25 M 果糖、G-6-P與10 μg/mL的bFGF在37℃條件下分別孵育48 h和7 d，以制備糖化bFGF。質譜顯示果糖孵育48 h后，bFGF被糖化。高效液相色譜法證實糖化bFGF制備成功。

體外制備糖化蛋白已有很多報道，多種條件均可成功制備糖化蛋白。這些研究涉及不同濃度的孵育原料，孵育時間從 1 h 至 30 d 不等[5，7-8，11]。其中，生長因子糖化的孵育最長為168 h[7]。相關研究表明，果糖能夠更好地與蛋白發生糖化反應[5，7]。本實驗結果顯示，果糖與bFGF孵育48 h，質譜顯示的峰值最為明顯。高效液相色譜法檢測結果也給予了證實。

細胞實驗中，我們對干預條件進行了篩選。結果顯示，在2 ng/mL到80 ng/mL的濃度區間內，經過24 h培養，bFGF和糖化bFGF均表現出對血管內皮細胞的促增殖效應，兩組在20 ng/mL濃度下OD值的差異最為明顯，故我們以此作為最終干預條件。在20 ng/mL濃度bFGF和糖化bFGF條件下進行1 d的細胞培養，細胞數量均可增加，但bFGF干預后的細胞數量增加更為顯著[7-8]，符合本實驗的結果。

以該干預濃度，我們觀察了1 d、3 d、7 d的細胞增殖、凋亡。結果顯示，與空白組相比，bFGF組表現出更好的促增殖效應，糖化bFGF組僅在第1天表現出促增殖效應，其余時相點未見明顯差異。在凋亡檢測中，糖化bFGF組在干預后第7天的細胞凋亡較bFGF組更為明顯。從總體上看，糖化bFGF在本實驗條件下無促增殖效應，但也未表現出抑制細胞增殖的效應，且在一定干預時間后誘導細胞凋亡。

對于上述結果，我們認為bFGF的促增殖效應是肯定的。但糖化bFGF并未表現出對細胞增殖的負調控作用，可能是本研究制備的糖化bFGF為包含糖化與非糖化bFGF的混合物，因此當用于干預細胞時，對于細胞增殖的影響可能是一種綜合效應，既包含了未糖化bFGF的促增殖效應，也包含了糖化bFGF的增殖抑制效應，最終表現為與正常培養條件相似的細胞增殖效應。但因糖化bFGF的存在，隨干預時間延長，仍會表現出誘導細胞凋亡的效應。

本實驗中，細胞成管效應的結果與細胞增殖有所不同。bFGF干預細胞后能促進血管形成；糖化bFGF干預后，細胞的成管明顯抑制。事實上，血管內皮細胞在Matrigel培養條件下形成管樣結構，不僅與細胞增殖有關，還涉及細胞遷移等其他細胞行為。這些行為與細胞骨架、細胞外基質骨架等多種復雜因素有關。文獻顯示，糖化蛋白與這些分子事件顯著相關[12-13]。本實驗所制備的糖化bFGF，不能促進細胞增殖，但理論上可負向介導與細胞遷移相關的分子事件，從而表現為抑制血管形成。

綜上所述，我們用果糖與bFGF在37℃溫箱中孵育48 h，成功制備出糖化bFGF。bFGF可明顯促進細胞增殖，對血管形成效應也有促進作用；糖化bFGF未顯示出對細胞增殖的明顯作用，但對血管形成有抑制作用。本實驗為后期開展生長因子糖化后受體相關事件提供了基礎，也對糖尿病創面的難愈機制研究提出了新的思路。