采種期對鹽脅迫下泡桐種子萌發和幼苗生長的影響

王孟筱， 曹幫華， 崔田田， 陳海燕2， 趙文軒， 毛培利

(1.山東農業大學黃河下游森林培育國家林業局重點實驗室， 山東 泰安 271018；2.泰安市徂徠山林場， 山東 泰安 271027)

高質量的種子具有更好的生長優勢和生產潛力，而確定種子最佳成熟期是實際生產實踐中豐產的基礎[1]。采收過早，容易造成種子成熟度差、活力低、質量差；而采收過晚，則會導致種子收獲減少以及成熟后劣變引起活力降低。在成熟過程中，伴隨母體植株不斷提供營養，種子本身也發生著一系列生理變化，體現在外觀形態和顏色變化、千粒重增加、含水量降低、營養物質(可溶性糖、淀粉和蛋白質等)積累、內源激素(GA、ABA和乙烯等)含量等變化[2]。王文章等研究表明，成熟度對紅松種子萌發的影響，除了與成熟過程中的生理生化變化有關外，也與種子內部發芽抑制物質有關[3]。周健等研究表明，紫荊種子隨著成熟度提高，種皮表面氣孔消失，蠟質開始形成并逐漸加厚，角質層和柵欄層可能是影響種皮透性進而引起休眠的原因之一[4]。楊玲等研究表明，種皮機械障礙作用是限制調制干燥前發育中的花楸種子萌發的重要因素[5]。由于不同植物有著不同的種子形成規律，因此其成熟特征也不盡相同[6]。種子成熟度不僅影響種子發芽能力和出苗整齊度，還進一步影響幼苗的品質[7]。賈然然等研究表明，毛葉山桐子種子在深紅果階段播種最佳，在黑褐果階段果實霉變，影響種子活力和發芽整齊度[8]。目前種子成熟度對小麥[9-11]、玉米[12-13]等農作物研究較多，對木本植物研究較少。近年來，有研究表明種子成熟度還影響其在逆境條件下的萌發進程。王淑英等研究表明，灌漿前期的玉米種子具有一定的發芽率，但種子抗低溫冷害能力差，隨著灌漿時期的延后，種子成熟度提高，抗逆能力逐漸增強[13]。藺吉祥等研究表明，羊草種子是具有一定耐鹽性的淺播種子，不同成熟度的羊草種子同樣表現出不同的耐鹽性和不同的抗深埋特性，成熟度越高，種子活力越大，種子抗鹽性和抗深埋性越強[14-15]。

在種子萌發過程中，鹽脅迫首先通過滲透脅迫阻礙種子水分的吸收，從而影響其萌發；其次，鹽進入種子會因離子毒害打破種子細胞內離子穩態，產生活性氧自由基?；钚匝踝杂苫T發氧化脅迫造成生物大分子結構的損傷，進而對細胞的代謝造成有害的影響，導致種子內細胞水平的損傷，進一步抑制種子的萌發。大量的研究表明，不同植物種子在鹽脅迫下的萌發有著顯著差別。對于鹽生植物，其種子在鹽脅迫下有著高的發芽能力，可以耐受很高的土壤鹽含量，一定的鹽分會促進鹽生植物種子的萌發。藺吉祥等研究表明，相對較低的鹽濃度有利于羊草種子的萌發，而羊草種子在低濃度鹽脅迫下的復萌率較低，隨鹽脅迫濃度不斷增加，其發芽能力受到刺激，復萌率也隨之增加[13]。而對于非鹽生植物，其種子在鹽脅迫下發芽能力顯著降低，只能耐受很低的土壤含鹽量。因此，闡明植物種子耐鹽萌發能力對鹽堿地育苗及播種造林具有重要的實踐意義。

泡桐(PaulowniaSieb.et Zucc)是玄參科(Scorphulariaceae)泡桐屬(Paulownia)植物，落葉喬木，原產我國。泡桐實生苗的耐鹽極限為0.2%～0.3%[16]，具有一定的耐鹽能力，是鹽堿地造林重要樹種之一[17]。前人對泡桐種子在鹽脅迫條件下的育苗工作研究不多，關于不同成熟度的泡桐種子耐鹽性研究還未見報道。因此，通過采集不同成熟時期的泡桐種子研究其在鹽脅迫下的發芽能力，研究種子成熟度與耐鹽能力的關系，可為泡桐在鹽堿地區的推廣應用提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試泡桐種子采自泰安市泰山區8年生泡桐人工林。采種母樹平均胸徑為25 cm，平均樹高為15 m。9月初泡桐蒴果已逐漸飽滿，果皮呈綠色；至9月底10月初，蒴果顏色變深綠至深棕并逐漸開裂；10月中旬到10月底，泡桐蒴果顏色進一步變深至棕黑色，果莢開裂數增加?；诖?，分別于2017年9月10日(記作Ⅰ)、9月30日(記作Ⅱ)、10月20日(記作Ⅲ)分3次用高枝剪采集果實飽滿、大小均勻且成熟狀態一致的泡桐蒴果。帶回實驗室后，剖開果莢，取出種子，去掉雜質，測定種子的千粒重和相對含水量。

1.2 試驗設計

前人所作泡桐種子在鹽脅迫下萌發能力的研究中試驗設置鹽濃度最大為3‰，為進一步探究泡桐種子耐鹽極限，設置實驗組鹽濃度為1‰、3‰和5‰，將3個采種期的種子分別在該3種濃度的NaCl溶液下進行發芽試驗，清水作為對照。將種子先用清水在室溫下浸泡24 h，然后用3‰ KMnO4溶液浸泡30 min消毒。無菌水沖洗3次，將種子擺入90 mm口徑的培養皿內。培養皿底部鋪消毒海綿，上覆一層吸水濾紙做發芽床。每個培養皿擺100粒種子，4次重復。每個培養皿加入配好的等量不同濃度的鹽溶液。按照《GB 2722-1999林木種子檢驗規程》[19]的規定，將培養皿放置在光照和黑暗各12 h，光照強度12 000 lx，相對濕度85%，溫度25 ℃的恒溫生化培養箱內進行發芽試驗，觀察22 d。萌發過程中每24 h觀測1次。當胚根突破種皮接近種子等長時，即認為種子萌發，記錄種子萌發起始時間和每日萌發種子數量。在萌發過程中，根據培養皿中水分的消耗情況每天補充水分至原刻度。

試驗結束后，把幼苗取出清洗干凈，用濾紙把表面水分吸干，稱重幼苗的鮮重(g)，測量胚軸長度(mm)，然后統計發芽指標及幼苗生長狀況。

1.3 指標及測定方法

發芽指標包括發芽率、發芽勢、平均發芽時間、發芽指數和活力指數。

發芽率(%)=(G1/N)×100%，式中：G1為萌發數，N為供試種子總數。

發芽勢(%)=(發芽高峰期發芽的種子數/N)×100%。

發芽時間=∑(D×n)/∑n，式中：n為對應各日正常發芽的粒數，D為種子置床起的天數。

發芽指數=∑(Gt/Dt)，式中：Gt為各日凈發芽數；Dt為相應發芽日。

活力指數=S×GI，式中：S為幼苗鮮重；GI為發芽指數。

1.4 數據處理

所有數據采用SPSS 22.0軟件(SPSS，Chicago，IL，USA)進行分析。用單因素方差分析法(One-Way ANOVA)分析了種子成熟時期對千粒重、相對含水量的影響；用雙因子方差分析法(Two-Way ANOVA)比較種子成熟時期和鹽濃度對種子萌發各指標的影響。若差異顯著，再用最小顯著差異法(LSD)進行多重比較。顯著性差異檢驗水平是p<0.05。

2 結果與分析

2.1 不同采種期泡桐種子千粒重及含水量差異

隨著采種期的推遲，泡桐種子的千粒重逐漸增加，千粒重平均值分別為0.16 g、0.20 g、0.24 g(圖1)；泡桐種子的相對含水量逐漸降低，相對含水量分別為52.18%、43.74%、34.60%(圖2)。方差分析結果表明，采種期對泡桐種子含水量有著顯著影響(F=6.020，p<0.05)，Ⅰ<Ⅱ<Ⅲ(p<0.05)；但對千粒重影響不顯著(F=1.257，p>0.05)。

圖1 隨種子采摘日期增加種子千粒重的變化

圖2 隨種子采摘日期增加種子含水量的變化

2.2 不同采種期泡桐種子鹽脅迫下的萌發特性

2.2.1發芽率和發芽勢

隨著采種期的推遲，種子發芽率和發芽勢呈低-高-低的變化趨勢。Ⅱ的種子發芽率和發芽勢最高；隨鹽脅迫濃度的增加，發芽率和發芽勢均逐漸降低(圖3、圖4)。雙因素方差分析結果表明，采種期對發芽率和發芽勢有著極顯著的影響；鹽脅迫對發芽率有顯著影響，對發芽勢有極顯著影響；二者的交互作用對發芽率和發芽勢影響不顯著(表1)。不同采種期間，Ⅰ與Ⅲ的種子發芽率差異不顯著(p>0.05)，極顯著低于Ⅱ(p<0.01)。不同采種期間，Ⅰ與Ⅲ的種子發芽勢差異不顯著(p>0.05)，顯著低于Ⅱ(p<0.05)。不同鹽分脅迫梯度之間，對照的發芽率和發芽勢都顯著高于鹽濃度為3‰和5‰(p<0.05)。

2.2.2平均發芽時間

隨鹽濃度的增加，不同采種期的泡桐種子平均發芽時間呈上升趨勢(圖5)。雙因素方差分析結果表明，采種期對平均發芽時間影響不顯著；鹽脅迫對平均發芽時間影響極顯著；而二者的交互作用不顯著(表1)。不同鹽分脅迫梯度之間，對照種子的平均發芽時間顯著低于3‰(p<0.05)，極顯著低于5‰(p<0.01)，1‰平均發芽時間極顯著低于5‰(p<0.01)。

圖3 不同采種期種子在鹽脅迫下的發芽率

圖4 不同采種期種子在鹽脅迫下的發芽勢

圖5 不同時期采集的泡桐種子在不同鹽濃度下的平均發芽時間

2.2.3發芽指數

在不同采種期之間，Ⅱ的泡桐種子發芽指數最高(圖6)；隨鹽濃度的增加，泡桐種子發芽指數呈逐漸降低的趨勢。雙因素方差分析結果表明，采種期和鹽脅迫對發芽指數有著極顯著的影響，二者的交互作用不顯著(表1)。不同采種期之間，Ⅱ的種子發芽指數極顯著高于Ⅰ和Ⅲ的種子(p<0.01)。不同鹽脅迫濃度梯度之間，對照種子的發芽指數最高，并且極顯著高于3‰和5‰(p<0.01),1‰發芽指數極顯著高于5‰(p<0.01)。

2.2.4活力指數

在不同采種期之間，Ⅱ的種子活力指數最高；隨鹽濃度的增加，泡桐種子活力指數呈逐漸降低的趨勢(圖7)。雙因素方差分析結果表明，采種期和鹽脅迫對發芽指數有著極顯著的影響，二者的交互作用不顯著(表1)。不同采種期之間，Ⅱ的種子發芽指數極顯著高于Ⅰ和Ⅲ的種子(p<0.01)。不同鹽脅迫濃度梯度之間，對照種子的活力指數最高，并且極顯著高于鹽濃度為3‰和5‰(p<0.01)。

圖6 不同時期采集的泡桐種子在不同鹽濃度下的發芽指數

圖7 不同時期采集的泡桐種子在不同鹽濃度下的活力指數

表1 種子活力指標在采種期和鹽濃度下的顯著性

指標 采種期 鹽濃度 采種期×鹽濃度fpfpfp發芽率23.20<0.013.24<0.050.4300.85發芽勢5.36<0.017.18<0.011.820.12平均發芽時間1.860.174.97<0.011.180.34發芽指數12.30<0.016.48<0.011.240.31活力指數18.02<0.018.60<0.012.120.08

2.3 不同采種期的種子鹽脅迫下萌發幼苗的生長比較

隨采種期的推移，泡桐幼苗的鮮重和下胚軸長度呈先增加再降低的趨勢；隨著鹽濃度的升高，泡桐幼苗鮮重和下胚軸長度呈逐漸下降趨勢(圖6)。雙因素方差分析結果表明，采種期和鹽濃度對泡桐種子幼苗平均鮮重和下胚軸生長量有著極顯著的影響(表2)。在不同采種期之間，Ⅱ的種子有著最大的幼苗鮮重和下胚軸長度，顯著高于其它2個采種時間(p<0.05)。在不同鹽濃度之間，泡桐種子下胚軸生長量在鹽濃度為0和1‰之間差異不顯著(p>0.05)，極顯著大于3‰和5‰(p<0.01)，幼苗平均鮮重在鹽濃度為1‰下顯著大于3‰和5‰(p<0.05)。

圖8 不同采種期種子在鹽脅迫下的幼苗平均鮮重

表2 幼苗生物量指標與采種期和鹽濃度的顯著性

指標 采種期 鹽濃度 采種期×鹽濃度fpfpfp幼苗鮮重8.530<0.015.273<0.011.7410.140胚根生長量15.520<0.0123.097<0.012.7070.028

3 討 論

3.1 采種期對泡桐種子質量的影響

隨著種子不斷成熟，含水量逐漸降低，可溶性碳水化合物逐漸變為凝固態的蛋白質和脂肪，果實顏色變深，千粒重增加[20-21]。本試驗發現，隨著采集時間的推遲，泡桐種子含水量逐漸降低，這與喬孝祿等[22]、鄭昀曄等[23]和姚辰等[24]的研究結果一致。但含水量的降低與種子活力的關系比較復雜。喬孝祿等研究表明，沼生櫟種子隨含水量的降低，種子發芽率逐漸下降，當含水量降低至9.0%時，發芽率迅速下降為0%[22]。鄭昀曄等指出，煙草種子成熟早期種子含水量迅速下降，當含水量低于30%時下降趨勢減緩，同時萌發能力出現峰值[23]。姚辰等研究表明，隨著水稻種子的逐步發育，含水量不斷降低，發芽率不斷提高[24]。本研究發現，隨著泡桐種子含水量降低，種子發芽率呈先增后降趨勢。表明種子活力與含水量的關系與樹種密切相關。泡桐種子含水量為43.74%、果莢顏色由深綠轉為棕黑色時發芽率最高，這可以作為在山東地區采集泡桐種子日期的重要依據。

采種期對種子活力和萌發幼苗生長有著顯著的影響。一些針葉樹后期脫落的種子質量比早期和中期的差。羅成榮等發現，柏木種子生理成熟期較其球果形態成熟期提前10～20 d，而形態成熟期的種子活力顯著降低，建議在生理成熟期進行采種[25]。姚辰等研究表明，水稻授粉9 d后的種子已經具備了發芽能力，17～21 d的種子發芽率最高，過熟的種子發芽率下降[24]。張鵬深入研究了水曲柳種子發育至成熟過程中的ABA含量、抑制物質活性和胚的離體萌發能力，發現種子發芽能力顯著受到內部抑制物質活性和ABA含量動態變化的影響[2]。本研究發現，泡桐種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數均是在第2次采種的9月30日數值最大，其活力的變化可能與其內部抑制物質和內源激素的變化有關。同時，合理的采種還可以顯著提高幼苗的質量，這在柏木種子[25]、日本三椏種子[26]都有相似結果。本研究也發現，此時采集的泡桐種子形成的幼苗有著最高的鮮重和下胚軸生長量。因此，建議山東地區在9月底左右開始觀察，當泡桐蒴果顏色變深并逐漸開裂時開始試采泡桐種子，測得種子平均含水量到達40%左右時即為最佳采種期，可進行大量采收。

3.2 鹽脅迫對種子萌發的影響

鹽脅迫是鹽堿地區種子萌發成苗最重要的限制因素。大量的研究表明，非鹽生植物的種子隨鹽濃度的不斷增加發芽率逐漸降低，這在青檀[27]、黑松[28]、羊草[14]、廣布野豌豆[18]上都有相似發現。對于泡桐，倪善慶[29]發現隨著鹽濃度的增加其發芽率逐漸降低，在單鹽濃度為5‰時發芽率為對照的60%。本研究發現，不同采種期的泡桐種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數都是隨鹽濃度的增加而降低，在5‰時發芽率分別為對照的25%、71%、35%，與倪善慶[29]的研究結果相似。鹽脅迫下，黑松種子萌發形成的幼苗的根長和根干重顯著降低[28]。王丹[18]發現廣布野豌豆胚根長和胚芽長均隨鹽濃度增加而逐漸降低。本研究發現，泡桐種子的幼苗鮮重和下胚軸生長量也是隨鹽濃度增加而顯著降低。對于羊草，其種子萌發指標均受種子成熟度和鹽脅迫交互作用的影響[14]。而泡桐只有下胚軸生長量顯著受到種子成熟度和鹽脅迫交互作用的影響，這表明不同植物的適應性不同。而植物種子成熟度對其抗逆能力的影響目前研究較少，需要進一步研究。

種子萌發是實生苗生產中幼苗建立的關鍵過程，其對抗鹽脅迫的能力與鹽堿地育苗造林成活率密切相關。而種子采收時的成熟度是影響種子質量的直接因素之一。本研究發現，隨著采種期的推移，泡桐種子含水量逐漸降低，種子活力先增加后降低。當采種期為9月底左右時，泡桐蒴果果皮顏色變深、部分開裂，種子含水量為40%左右，此時泡桐種子萌發能力和抗鹽能力最強。隨鹽脅迫濃度的增加，泡桐種子的發芽率逐漸降低。在鹽濃度為5‰時，其發芽率為對照的71%，具有一定的耐鹽能力。因此，在泡桐種子成熟后，結合種子的含水量及果實外觀，應及時采收，以獲取高活力的種子。