水分脅迫對葡萄果實白藜蘆醇合成相關基因表達的影響

席 奔 柳巧禛 呂丹桂 徐偉榮 王振平,2 代紅軍,?

(1寧夏大學農學院,寧夏銀川 750021;2寧夏大學葡萄與葡萄酒教育部工程中心,寧夏銀川 750021)

葡萄(Vitis vinifera L.)為葡萄科葡萄屬木質藤本植物,是世界范圍內重要的經濟類果樹之一。據聯合國糧食及農業組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)統計,2016年全球葡萄栽培面積達7.1×106hm2,其中我國栽培面積達8.4×105hm2, 占全球栽培面積的 11.8%。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是植物次級代謝產生的一種芪類化合物, 存在于 100 多種植物中, 在葡萄、虎杖(Polygonum cuspidatum Sibe.et Zucc)等植物中含量較高[1]。Res 及其衍生物具有抗血栓、抗氧化、抑制腫瘤等多種有益于人體健康的活性功能[2-3],還具有抵抗植物病原菌的作用[4-5]。Res 由苯丙烷類代謝途徑合成,參與合成的酶有苯丙氨酸裂解酶(phenylalanin ammonialyase,PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(cinnamic acid-4-hydroxylase,C4H)、4-香豆酸-CoA 連接酶(4-coumarate-CoA ligase, 4CL) 和芪合成酶(stilbene synthase,STS),其中STS 是Res 合成的關鍵酶(圖1)。葡萄STSs 基因家族由48 個基因組成,至少有32 個基因有潛在的生物學功能[6]。H?ll 等[7]發現轉錄因子MYB14 和MYB15 調節葡萄STS 基因的表達,表明Res合成受結構基因和調節基因的控制。Wang 等[8]研究表明,葡萄Res 的合成與積累不僅與葡萄基因型有關,還受外界環境的影響。

水分是限制農業生產的主要因素之一[9]。大量研究表明水分脅迫會導致植物形態和生理生化發生變化,如阻礙植物地上部分生長、降低植物蒸騰及光合作用、導致滲透化合物和離子的積累等[10-12]。Kennedy等[13]研究表明,水分會影響葡萄果實類黃酮物質的積累,進一步影響葡萄與葡萄酒品質。Castellarin 等[14]發現水分脅迫能誘導葡萄果實花青素和酚類物質的積累。但目前關于水分脅迫如何影響葡萄Res 合成與積累的研究尚鮮見報道。

本研究以釀酒葡萄赤霞珠(Vitis vinifera L. cv.Cabernet Sauvignon)為試驗材料,對其進行水分脅迫處理,利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法和實時熒光定量PCR 技術分別檢測葡萄果實Res 含量和Res 合成相關基因的表達量,分析Res 合成過程中Res 與相關基因表達量的關系,探究水分脅迫對葡萄果實Res 合成的影響,以期為進一步深入研究葡萄Res 合成調控機制奠定理論基礎。

圖1 白藜蘆醇生物合成途徑[15]Fig.1 Resveratrol biosynthesis pathway[15]

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為15年生赤霞珠,試驗在寧夏永寧縣(38.28°N,106.24°E)玉泉營葡萄園進行,該地區屬中溫帶干旱氣候,土壤類型為淡灰鈣土,土質為沙壤土。采用籬架栽培模式,“廠”字形整形,主干上每10 ～15 cm 留1 個結果枝,結果枝上留1 個穗果,產量約400 kg·667m-2,南北行向,株行距為0.5 m×3 m,冬季埋土防寒,灌溉方式為滴灌,滴灌流速為0.6 L·h-1。

于葡萄園中部選取長勢均一、無病蟲害的植株11行,每處理設3 次生物學重復,每重復30 株,不同處理之間間隔1 行(圖2)。結合葡萄園田間灌溉情況,并參考文獻[16]計算不同處理植株黎明前葉片水勢(φpredawn)。試驗共設3 個處理：1)對照(CK)植株黎明前葉片水勢在-0.20 Mpa ≥φpredawn≥-0.40 Mpa;2)處理組1(T1)植株黎明前葉片水勢在-0.40 Mpa ≥φpredawn≥-0.60 Mpa;3)處理組2(T2)植株黎明前葉片水勢在φpredawn≤-0.60 Mpa。2017年5月25日為葡萄盛花期(full bloom,E-L23)[17],6月20日綠果期(berry pea size,E-L27)即花后25 d 開始進行試驗處理,并測得植株黎明前葉片水勢為-0.30 Mpa,之后每5 d 監測1 次φpredawn,根據測定的φpredawn及試驗期間葡萄園日降雨量和日氣溫(圖3),確定各處理是否灌水及所需灌水量(表1)。

圖2 試驗設計示意圖Fig.2 Schematic diagram of test design

花后30 d(30 days after anthesis,30 DAA)開始采集果實,每10 d 采樣1 次,采樣在測定植株黎明前葉片水勢后進行,在植株東西兩側,隨機剪取果粒,一部分用于測定可溶性固形物(total soluble solid,TSS)和可滴定酸(titratable acid,TA)含量,另一部分液氮速凍后,-80℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 黎明前葉片水勢測定 黎明前(5：30-6：00)迅速摘取葡萄枝條中部節位的葉片,用潮濕的紗布包好,裝入塑封袋中,帶回實驗室,用刀片在葉柄末端切出斜面,切割后迅速裝入3005 型植物水分壓力室(美國Soil Moisture Equipment 公司)中,使葉柄末端切口從壓力室密封圈中部的小孔露出,固定好,擰緊鋼塞,關閉控制閥,此時緩慢轉動加壓閥,同時用放大鏡仔細觀察葉柄末端,當葉柄末端出現小水滴的一剎那,立即關閉加壓閥,此時讀數表盤指針所在位置的數值,即為葉片水勢的絕對值,記錄數值。每個處理選取3棵植株,每棵植株取3 片葉子。

圖3 試驗期間氣溫(A)和日降雨量(B)Fig.3 Air temperature (A) and daily rainfall (B)

1.2.2 百粒重測定 隨機取300 顆果實,利用電子天平(0.000 1 g)稱重,重復3 次,取平均值。

1.2.3 可溶性固形物含量測定 在室溫下,隨機取果實100 顆于塑封袋中,手工擠汁,然后取適量果汁用WYT-32 手持糖量折光儀(福建省泉州光學儀器廠),重復3 次,取平均值。

1.2.4 可滴定酸含量測定 將1.2.3 中剩余的果汁轉移至離心管中,5 000 r·min-1離心10 min,取10 mL上清液于100 mL 容量瓶中,蒸餾水定容。取20 mL 定容后的液體于三角瓶中,用0.05 mol·L-1NaOH 溶液滴定。果實中可滴定酸含量以酒石酸計。

1.2.5 白藜蘆醇測定 參照李曉東等[18]的方法。取1 g 葡萄樣品,液氮研磨至粉末狀后,用10 mL 乙酸乙酯浸提,超聲提取(80 Hz,30℃)12 min,然后4℃避光浸提1 h,10 000 r·min-1離心10 min。取上清液,殘渣中加入5 mL 乙酸乙酯重新離心取上清液,合并上清液轉移至圓底燒瓶中,40℃旋轉蒸干,干燥物用2 mL 甲醇(色譜純)溶解,置于2 mL 離心管,-20℃避光貯存。高效液相色譜條件：AGILENT1100 型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司);C18 柱子(250 mm×4.6 mm,5 μm);二極管陣列(DAD);檢測波長306 nm;流動相乙腈∶水(40 ∶60,v/v),流速0.8 mL·min-1;柱溫30℃;進樣量10 μL。

1.2.6 總RNA 的提取和實時熒光定量PCR 總RNA 提取按照RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒DP441 說明書進行。以總RNA 為模板,利用PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real time)試劑盒進行反轉錄與純化。選取EF1、Actin 為內參基因,PAL、4CL、CHS、STS、Myb14、Myb15 基因引物用Primer 5.0 設計,引物由蘭州生工合成部合成(表2)。RT-qPCR 反應體系為25 μL：cDNA(100 ng·μL-1)1 μL,上游引物和下游引物各0.5 μL,2×UltraSYBR Mixture 12.5 μL,ddH2O 10.5 μL。RT-qPCR 擴增程序：95℃預變性10 min;94℃變性10 s,54～56℃退火30 s,40 個循環;72℃延伸32 s。每個模板設3 次生物學重復,取平均值。目的基因相對表達量采用2-ΔΔCt法[19]計算。

表2 RT-qPCR 引物序列Table 2 Primer sequences of RT-qPCR

1.3 數據統計與分析

采用SAS 8.2 進行數據處理與統計分析,Excle 2010 和SigmaPlot 12.0 進行繪圖,通過SNK 法進行ANOVO 分析,數據以平均值±標準差(SD)表示。

2 結果與分析

2.1 水分脅迫對葡萄果實百粒重、可溶性固形物及可滴定酸的影響

由圖4 可知,25 ～70 DAA,CK φpredawn在-0.19 ～-0.48 MPa 范圍內;60～65 DAA 的降雨導致φpredawn上升,同樣,85 ～90 DAA 也出現相似的情況。雖然降雨引起了φpredawn上升,但在采樣時各處理φpredawn均在試驗設定范圍內。70 ～75 DAA 雖有降雨但降雨量較小且降雨恰巧在測定φpredawn之后,所以φpredawn呈下降趨勢。

各處理均在2017年4月24日葡萄萌芽,5月25日盛花(50%的花帽脫落),6月8日坐果,6月13日(20 DAA)出現幼果,轉色(E-L35)時間各處理存在差異,其中CK 為7月30日(65 DAA)-8月4日(70 DAA)、T1 為7月23日(58 DAA)-7月29日(64 DAA)、T2 為7月25日(60 DAA) -8月1日(67 DAA),各處理均在9月13日(110 DAA)收獲。

圖4 不同處理黎明前葉片水勢Fig.4 Leaf water potential predawn for different treatments

由圖5-A 可知,隨著生育進程的推進,各處理百粒重呈先增加后趨于平穩的變化趨勢,其中CK 不同花后天數百粒重均顯著大于T1、T2(60 DAA 除外),110 DAA 時達到最大,為115.97 g,T1、T2 分別為109.34 g、82.53 g。由圖5-B 可知,隨著生育進程的推進,各處理TSS 含量逐漸增加,其中60 ～70 DAA增速最快。不同處理之間TSS 含量存在明顯差異,轉色前T2 的TSS 含量均顯著高于CK 和T1,T1 與CK 差異均不顯著;轉色后T1 的TSS 含量明顯增加且高于T2,但總體上低于CK,表明短期的水分脅迫能夠提高果實TSS 含量,但長期的脅迫會降低TSS含量。由圖5-C 可知, 隨著生育進程的推進,各處理TA 含量呈逐漸降低的趨勢,其中轉色期TA 含量下降明顯,不同處理間TA 含量差異明顯。T2 的TA含量除了在40 DAA 和100 DAA 時高于CK,其余時期均低于CK,成熟期(110 DAA)CK、T1、T2 的TA 平均含量分別為7.36、6.19 和7.28 g·L-1FW,且T1的TA 含量明顯低于CK 和T2,表明水分脅迫會降低TA 含量。

2.2 水分脅迫對葡萄果實白藜蘆醇含量的影響

圖6-A 為Res 標準品溶液的色譜圖,其保留時間為4. 705 min;圖6-B 為樣品色譜圖,表明試驗能較好地提取及檢測到Res。以標準樣品濃度為橫坐標,對應峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,得到線性回歸方程：y=108. 2 x-1. 73,y 表示306 nm 波長處的面積,x 表示Res 的濃度,相關系數R2=0. 999 7,表明標準曲線線性良好,能對樣品中的白藜蘆醇進行定量分析。

白藜蘆醇含量在果實轉色前含量較低在轉色后快速增加,即隨著果實逐漸成熟而增加。不同處理對白藜蘆醇含量影響存在差異,T1 和T2 均能增加白藜蘆醇含量,其中T1 效果最佳。60 ～100 DAA 期間,T1 均極顯著高于CK 和T2,且在90 DAA 時達到最大,為20.41 μg·g-1FW,是CK 的7.70 倍(表3)。

2.3 水分脅迫對白藜蘆醇合成相關基因表達量的影響

由圖7 可知,隨著果實進入轉色期,白藜蘆醇合成相關基因上調表達,果實完全著色后,又開始下調表達。70 DAA 時,T1 和T2 的PAL、4CL、STS、MYB14和MYB15 表達量均高于CK;80 DAA 時,T1 的PAL、4CL、MYB15 表達量高于CK,而STS、MYB14 低于CK;90 DAA 與70 DAA 相似,其中T1 PAL、STS 表達量達到最大,且與CK 差異極顯著,分別是CK 的2.4倍和2.6 倍,而T2 明顯低于CK;100 DAA 和110 DAA 時,T1 的PAL 和4CL 表達量也高于CK,且與CK 差異顯著,MYB14 和MYB15 表達量均為T1 高于CK,T2 低于CK,T1 STS 表達量則低于CK。CHS 雖然不直接參與白藜蘆醇合成,但與STS 有共同的作用底物(4-香豆酰CoA),除60 DAA,其他時期T1 和T2 的CHS 表達量均極顯著低于CK,表明水分脅迫導致CHS 下調表達。

圖5 不同處理葡萄果實百粒重、可溶性固形物及可滴定酸含量Fig.5 Total soluble solids content and 100 grains weight and titratable acid content of grape barries with different treatments

2.4 白藜蘆醇含量與白藜蘆醇合成相關基因表達量的相關性分析

葡萄果實白藜蘆醇含量與白藜蘆醇合成相關基因表達量的相關性分析結果表明,在果實成熟過程中,白藜蘆醇合成與相關基因的表達量具有一定的相關性,CK 的STS 基因表達量與白藜蘆醇含量呈顯著正相關,相關系數為0.823(P = 0.044 2 ＜0.05)。T2 的PAL、STS 基因表達量與白藜蘆醇含量呈顯著正相關,相關系數分別為0.788(P=0.042 4＜0.05)、0.852(P=0.031 2＜0.05)(表4)。表明水分脅迫提高了相關基因的表達量。

表3 水分脅迫對葡萄果實白藜蘆醇含量的影響Table 3 Effect of water stress on resveratrol content of grape berries/(μg·g-1FW)

圖6 白藜蘆醇標準品(A)及試驗樣品(B)色譜圖Fig.6 The chromatograms of standards of resveratrol(A)and test sample(B)

表4 不同處理下白藜蘆醇含量與白藜蘆醇合成相關基因表達量的相關性分析Table 4 Correlation analysis of transcription level of resveratrol biosynthesis related genes and resveratrol content

3 討論

白藜蘆醇是植物產生的一種抗毒素,受病原體感染[20]、紫外線輻射[21]、機械損傷[22]等生物或非生物脅迫誘導產生。Vezzulli 等[23]研究表明,巴貝拉葡萄(V.vinifera cv. Barbera)果實在水分脅迫下芪類化合物積累量未增加。這與本試驗結果不一致,可能是因為不同品種葡萄中白藜蘆醇的分布和對生物或非生物脅迫響應存在差異[24]。Castellarin 等[14]研究表明,水分脅迫會導致PAL 基因表達量增加并誘導類黃酮物質的積累。本研究也發現,水分脅迫使PAL 基因表達量顯著增加且PAL 基因表達量與白藜蘆醇含量呈顯著正相關,表明水分脅迫可通過誘導PAL 基因進一步增加白藜蘆醇積累量。STS 是白藜蘆醇合成的關鍵酶。H?ll 等[7]證明了MYB14 和MYB15 能夠調控葡萄STS基因表達。本試驗中水分脅迫導致葡萄果實轉色前期和成熟期STS 基因表達量增加,且T2 的MYB14、MYB15 與STS 基因表達量的變化趨勢相似,但相關性分析表明MYB15 表達量與白藜蘆醇含量呈負相關,推測MYB14 可能響應水分脅迫參與調控STS 基因表達。王琴飛[25]研究認為,CHS 雖然不直接參與白藜蘆醇合成,但與STS 有共同的作用底物。在自然條件下苯丙氨酸代謝途徑通過CHS 酶合成花色素和其他酚類物質,而當植物遭遇逆境脅迫時,會激活STS 基因進入二苯乙烯途徑合成白藜蘆醇。本試驗中水分脅迫使葡萄果實CHS 基因表達量顯著下降,而STS 基因表達量顯著增加,進一步誘導白藜蘆醇含量增加提高了植株的抗逆性。

圖7 水分脅迫對葡萄果實白藜蘆醇合成相關基因表達量的影響Fig.7 Effects of water stress on transcription level of resveratrol biosynthesis related genes in grape berries

殷向靜[26]對山葡萄(Vitis amurensis Rupr)轉錄組進行測序分析發現,白藜蘆醇合成受激素、轉錄因子、STSs 基因及其上下游基因等的調控,進一步分析發現,STSs 基因上游調控區域含有多種順式作用元件,主要包括光響應元件ACE、GT1-motifi 和G-box、環境特異性元件TC-rich repeats(參與干旱脅迫響應)、過程特異性元件ABRE(脫落酸響應元件)、CGTCA-motif(茉莉酸甲酯響應元件)等。Chaves 等[27]研究表明,水分脅迫會導致植物芽減少、抑制葉的生長從而改變植物冠層結構,使植物暴露在太陽光下的機率增大。光和熱效應會導致一些靶基因的轉錄調控功能發生變化,如水分脅迫下葡萄黃酮類化合物代謝途徑的基因。因此,推測水分脅迫可以通過STSs 基因上游的光響應元件參與調控白藜蘆醇的合成[28-29]。但具體是哪種主要的光響應元件參與水分脅迫誘導白藜蘆醇的合成還有待進一步研究。此外,水分脅迫也會改變植物內源激素含量,如增加脫落酸、水楊酸含量等[30-31]。研究表明外源水楊酸處理可以使PAL、STS 基因表達上調,且能增加葡萄細胞白藜蘆醇含量[32]。脫落酸反應元件結合因子VvABF2 過表達可以明顯增加葡萄轉基因細胞系白藜蘆醇和反式白藜蘆醇苷(trans-piceid)的積累[33]。不同STSs 基因啟動子中含有的順式作用元件的種類和分布不同,對不同激素的響應也有差異,最終導致STSs 基因產生差異的表達模式[26]。但STSs 基因中具體哪些成員在水分脅迫誘導白藜蘆醇合成中起主導作用尚不清楚。因此,水分脅迫誘導白藜蘆醇積累的機制還需進一步研究。

4 結論

本研究結果表明,短期的水分脅迫能夠提高果實可溶性固形物含量;水分脅迫會降低果實可滴定酸含量,增加果實白藜蘆醇含量;水分脅迫對果實轉色前期和后期PAL、STS 基因表達的促進作用最為顯著,但也會顯著降低CHS 基因的表達,表明水分脅迫主要通過誘導PAL、STS 基因表達從而提高果實白藜蘆醇含量。綜合來看,黎明前葡萄葉片水勢在-0.40 Mpa ≥ψpredawn≥-0.60 Mpa 處理下花后100 d 采收釀酒葡萄較好,此時果實可溶性固形物含量為18.50%,可滴定酸含量為7.31 g·L-1FW,白藜蘆醇含量為16.28 μg·g-1FW。本研究為提高富含白藜蘆醇的釀酒葡萄原料以及進一步探究葡萄白藜蘆醇合成調控機制提供了理論依據。