基于Label-free組學研究南極磷蝦油對脂代謝的影響

張迪雅 崔晨茜 何曉倩 李 曄 蘇秀榕

(寧波大學海洋學院,浙江寧波 315211)

南極磷蝦油中富含不飽和脂肪酸,其中二十碳五烯酸(eicosapntemacnioc acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid,DHA)含量高達15.86%,且主要以磷脂(phospholipids,PL)形式存在[1-2]。研究表明,以磷脂形式存在的EPA 和DHA 更易被生物體吸收[3-6]。南極磷蝦油具有調節脂肪代謝、降低血中總膽固醇和甘油三酯含量、清除過多脂質的作用[7-8],如Zhu 等[9]通過比較正常大鼠和高脂血癥大鼠攝入磷蝦油后血脂的變化情況,發現南極磷蝦油具有降低高脂大鼠甘油三酯和膽固醇水平的功能;Lee 等[10]研究了南極磷蝦油對高脂飼料喂養下小鼠血脂的影響,發現其能夠抑制甘油三酯的累積和降低血脂的水平;Burri等[11]和Ferramosca 等[12]發現,在飲食中補充磷蝦油可通過上調參與脂質氧化的基因和下調參與脂肪生成的基因來抑制脂質合成。

基于Label-free 的蛋白質組學,即非標記定量蛋白質組學技術,是通過LC-MS 對蛋白質酶解肽段進行質譜分析,比較不同樣品中相應肽段的信號強度,依據相同肽段的質譜響應強度與含量成正比,從而對肽段對應的蛋白質進行相對定量[13]。Kalayou 等[14]通過非標記定量蛋白質組學對暴露于持續性污染物3-甲磺酰-DDE的原代新生豬睪丸間質細胞的蛋白表達情況進行了研究,發現3-甲磺酰-DDE 主要作用于線粒體功能障礙、氧化磷酸化、EIF2 信號傳導和谷胱甘肽介導的解毒作用等途徑,進一步鑒定和表征這些蛋白質有助于了解3-甲磺酰-DDE 對內分泌系統干擾的分子機理;Gang等[15]通過非標記定量蛋白質組學建立了急性白血病在兒童中患病的風險標記,發現高風險急性淋巴細胞白血病的發病往往與涉及前體mRNA 的剪切、DNA 損傷反應和應激反應相關蛋白的差異表達有關。

前期研究證實,灌胃南極磷蝦油后,可有效降低高脂模型小鼠血清中的總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平,并提高高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平[16]。為進一步闡明南極磷蝦油對小鼠脂代謝的調控機理,本研究采用基于Label-free 的蛋白質組學技術分析灌胃南極磷蝦油后,高脂小鼠肝臟中脂代謝相關蛋白質的表達變化情況,以期為后續研究南極磷蝦油對肝臟脂代謝調控機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性ICR 小鼠,體重23.33±2.17 g,購自浙江實驗動物中心公司,許可證號： SCXK(浙)2014-0001。

普通飼料由浙江省動物實驗中心提供;高脂飼料配方：豬油10%、膽固醇2.5%、膽酸鹽約1%、蔗糖20%、普通飼料66.5%。BCA 蛋白定量試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;乙腈(質譜純),美國Fisher 公司;甲酸(色譜純),美國Sigma 公司;其他生化試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器與設備

Model680 型酶標儀,美國Bio-Rad 有限公司;GL20M 型高速冷凍離心機,上海盧湘離心機儀器有限公司;LC-MS 安捷倫科技有限公司;ACQUITY UPLC,美國 Waters 公司; Synapt High Definition Mass Spectrometry 高解析質譜儀, 美國 Waters 公司;Tissuelyser-48 組織研磨儀,上海凈信實業有限公司;Scientz-25T 冷凍干燥儀,寧波新芝凍干設備股份有限公司;REDS 酶解儀,美國HST 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物分組與處理 健康ICR 小鼠隨機分為3組,每組8 只,共計24 只。適應性喂養一周后,正常組喂食普通飼料,灌胃生理鹽水;模型組和試驗組喂食高脂飼料進行造模,同時模型組灌胃生理鹽水,試驗組灌胃600 mg·kg-1的南極磷蝦油,連續喂養30 d。末次喂食后,禁食不禁水10 h,處死后,仔細剝離肝臟,稱重,-80℃保存備用。

1.3.2 肝臟預處理和蛋白質分離 小鼠肝臟組織剪成碎片,用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)清洗后,收集組織碎片到EP 管中,按照細胞濕重∶裂解液=1 ∶3(v/v)比例加入裂解液[4%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)+0.1% 苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)+1×磷酸酶抑制劑],然后置于組織研磨儀中,高頻(65 Hz)振蕩1 min,重復操作5 次。冰浴條件下超聲(200 W)3 min,再于4℃條件下14 000 r·min-1離心40 min,保留上清液。按照BCA 試劑盒說明書進行蛋白質定量,12%SDS-PAGE 進行蛋白質分離。

1.3.3 酶解及多肽純化 膠條以1 mm×1 mm 的形式放入EP 管中,水洗、脫色,還原烷基化,膠內胰蛋白酶酶解,于酶解儀中37℃條件下反應15 h。反應結束后,立刻加入40 μL 肽段提取液(50% 乙腈+0.1% 三氟乙酸),37℃條件下反應30 min。將產物轉移至新的EP 管中,反復進行2 次肽段提取。反應結束后,置于冷凍干燥儀中凍干。

1.3.4 質譜分析 質譜條件：使用Synapt High Definition Mass Spectrometry 高解析質譜儀,正離子檢測模式,一級分辨率為70 000,AGC 設置為1e6,噴霧電壓2 500 Ⅴ,掃描范圍350～1 600 m/z。選取10 個強度最高的離子進行MS/MS 分析,二級分辨率為17 500,AGC 設置為2e5,分離窗口為2.0 m/z;

液相條件：色譜柱為C18(250 mm×75 μm,粒徑3 μm),流動相A 為含0.1%甲酸的乙腈,流動相B 為含0.1%甲酸的水溶液,流速為300 μL·min-1,進樣體積為4 μL。具體洗脫梯度見表1。

1.3.5 數據庫搜索和生物信息學分析 質譜數據采用MaxQuant (1.5.6.5) 進行數據庫檢索,使用數據庫為Mouse 蛋白庫數據庫,來源于Uniprot 數據庫。將MaxQuant 搜庫結果文件中數據重新進行分析,篩選差異蛋白。將不同樣本中全部檢測到的蛋白進行非標記定量計算,將蛋白在不同樣本的蛋白強度(IBAQ)值進行兩兩比較,得到每個蛋白在任意兩組樣本中的變化倍數值(ratio)。蛋白在兩組樣本中表達量變化≥2 倍或者≤0.5 倍,則視為該蛋白在2 個條件下表達量有明顯差異。根據蛋白數據庫中的GO 注釋,分別根據分子功能(molecular function,MF)、細胞組分(cellular component,CC)、參與的生物過程(biological process,BP)進行分析,并對脂代謝相關差異蛋白通過String(10.0)進行相互作用可視化網路圖分析。

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦油對小鼠肝臟蛋白質表達的影響

通過Label-free 蛋白質組學分析,共鑒定出1 943個蛋白質。與模型組相比,正常組小鼠肝臟中共有204 個差異蛋白,其中109 個表達上調,95 個表達下調;喂食南極磷蝦油后的試驗組中,共鑒定出224 個差異蛋白,其中125 個表達上調,99 個表達下調。而與正常組相比,試驗組共有264 個差異蛋白,其中137 個表達上調,127 個表達下調。

對上述差異蛋白進行GO 分析,根據細胞組分、分子功能和生物學過程三大類進行注釋,并對GO 注釋的條目統計對應的差異蛋白數(圖1)。結果顯示,與模型組相比,正常組和試驗組中的差異蛋白相似,在細胞學組分中大多數與細胞質有關,包含位于線粒體、膜、核質、內質網膜等細胞質蛋白;在分子功能中主要為結合蛋白,包括ATP 結合蛋白和金屬離子結合蛋白等;生物學過程中為具有細胞內蛋白質運輸與翻譯等功能蛋白。而與正常組相比,試驗組的差異蛋白GO分析的功能注釋與上述相似。根據此結果可從分子水平推測,南極磷蝦油的攝入有助于高脂小鼠肝臟蛋白的表達接近于正常小鼠。

圖1 差異蛋白TOP10 GO 富集分析Fig.1 TOP10 GO enrichment analysis of differentially expressed proteins

2.2 脂代謝相關差異蛋白的統計分析

為了闡明南極磷蝦油對小鼠脂代謝的影響,進一步分析脂代謝相關蛋白的差異表達情況。本試驗共鑒定出84 個脂代謝相關蛋白。與模型組相比,正常組中有8 個表達上調,占比9.52%,12 個表達下調,占比14.28%,64 個表達無差異,占比76.19%(圖2-A);與模型組相比,試驗組中有14 個蛋白質表達上調,占比16.67%,表達下調的有8 個,占比9.52%,62 個蛋白質表達無差異,占比73.81%(圖2-B);試驗組與正常組相比,有17 個表達上調的蛋白質,占比20.24%,6個表達下調,占比7.14%,有61 個表達無差異,占比72.62%(圖2-C)。上述差異表達蛋白,包括了與脂質合成代謝、脂質分解代謝、膽固醇轉化及磷酯代謝等相關的蛋白質(表2)。

此外,與模型組相比,有7 個脂代謝相關差異蛋白在正常組和試驗組中均被鑒定出,且具有一致的表達趨勢。上述差異蛋白包括上調表達的棕櫚酰蛋白硫酯酶1 (palmitoyl-protein thioesterase 1, PPT1)、載脂蛋白B100(apolipoprotein B-100,APOB100)、短支鏈?；o酶A 脫氫酶(acyl-CoA dehydrogenase,short/branched chain,ACADSB)、3 - 羥基?；?CoA 脫水酶3 (3-hydroxyacyl-CoA dehydratase 3,HACD3)和磺基轉移酶1A1(sulfotransferase 1A1,SULT1A1);下調表達的?；o酶 A 合成酶家族成員3 (acyl-CoA synthetase medium-chain family member 3,ACSM3)、?；o酶A合成酶家族成員2(acyl-CoA synthetase family member 2, mitochondrial, ACSF2)。

上述差異蛋白質參與的主要信號轉導通路包括固醇類激素的生物合成、脂肪酸代謝、PPAR 信號途徑、亞油酸代謝、脂肪酸的生物合成和脂肪酸延伸。由表3 可知,ACADSB 在正常組和試驗組中均表達上調。與此相反,涉及脂肪酸合成的兩類重要的蛋白酶,脂肪酸去飽和酶2(fatty acid desaturase 2, FADS2)和長鏈脂肪酸延長酶2(elongation of very long chain fatty acidprotein 2, ELOV2)在試驗組中表達下調,但這兩類酶在正常組中并沒有差異表達。由此推測,FADS2 和ELOV2 在南極磷蝦油抑制脂質合成的途徑中發揮著重要作用。

表2 脂代謝相關蛋白Table 2 Lipid metabolism related proteins

圖2 脂代謝蛋白的差異表達情況Fig.2 Differential expression of lipid metabolism proteins

此外,細胞色素P450 家族的蛋白質,包括細胞色素P450 2D11(cytochrome P450 2D11、CYP2D11)、細胞色素P450 2C29(cytochrome P450 2C29、CYP2C29)、細胞色素 P450 2C39 ( cytochrome P450 2C39、CYP2C39)、細胞色素P450 2B9 (cytochrome P450 2B9、CYP2B9) 和細胞色素P450 3A13(cytochrome P450 3A13、CYP3A13),在各組中均有不同程度的差異表達。細胞色素P450 家族成員是一類血紅素硫醇鹽單加氧酶,該酶參與NADPH 依賴性電子傳遞途徑,在類固醇、脂肪酸的分解或合成代謝途徑,以及能量代謝中具有重要作用[17-18]。由此可見,南極磷蝦油的攝入對于小鼠機體中的能量代謝也產生了較大的影響。

表3 脂代謝KEGG 通路Table 3 Lipid metabolism KEGG pathway

2.3 脂代謝差異蛋白的相互作用分析

蛋白質- 蛋白質相互作用圖(protein-protein interactions,PPI)有助于了解差異蛋白的細胞功能和作用機制[19]。為了進一步說明上述差異蛋白在調節脂代謝中的作用方式,STRING(10.5)被用來檢測差異蛋白的功能關系,并生成PPI 網絡圖(圖3)。每個球體代表一種蛋白質,蛋白質的空間距離越近,代表它們的功能越接近。同時,蛋白質連接在一條直線段上,線段越多,蛋白質之間的相互作用越緊密。條紋之間的藍線表示蛋白質之間的功能關聯,線條的厚度代表所報告的相關信度水平[20]。

正常組中,除脂肪酸酰胺水解酶(fatty-acid amide hydrolase,FAAH)外,其他蛋白質在脂肪酸代謝過程中均有密切的相互作用(圖3-A);試驗組中,ACSM3 參與了?；o酶A 的代謝和脂肪酸β 氧化,說明脂代謝與糖代謝之間存在一定的密切聯系(圖3-B);在試驗組和正常組中,ACADSB、ACSM3 和ACSF2 均參與了脂肪酸代謝,并與其他蛋白具有密切的聯系。此外,與正常組相比,試驗組中除ELOVI2 外,其他蛋白質在脂肪酸代謝過程中均有密切的相互作用。上述結果表明, ACADSB、ACSM3 及ACSF2 這些蛋白質可能是南極磷蝦油調節脂代謝的重要調控蛋白。南極磷蝦油的攝入可能通過改變這些蛋白質的表達,進而改變下游的代謝途徑,達到降低血脂、減輕體重的作用。

圖3 脂代謝差異表達蛋白的蛋白質相互作用網絡分析Fig.3 The visualization network diagram of DEGs involved in lipid metabolism

3 討論

機體內的過量脂肪以三?；视偷姆绞竭M行存儲,并可能導致肥胖等一系列的疾病。以EPA、DHA為主的不飽和脂肪酸則可以通過調節脂肪代謝,起到預防肥胖和脂代謝相關疾病的作用。前期研究證實,喂食南極磷蝦油對高脂小鼠的體重起到了一定的抑制作用,表明南極磷蝦油對高脂小鼠有一定的降血脂作用,緩解了高脂誘導的脂代謝紊亂現象,這與目前已有的研究一致[16]。

本研究利用Label-free 蛋白質組學技術,對灌胃南極磷蝦油后高脂小鼠肝臟蛋白的差異表達情況進行分析,并對脂代謝相關差異蛋白的表達模式進行了比較。結果表明,與模型組相比, ACADSB 在試驗組和正常組中均表達上調,而ACSF2 和ACSM3 均下調。研究表明,ACADSB 基因缺失會造成異亮氨酸的代謝紊亂,在組織中產生2-methylbutyryglycine (2MBG) 和2-methylbutyric acid(2MB)的積累,2MBG 能促進硫代巴比妥酸的反應活性組分,導致脂質氧化增加[21]。ACADSB 的上調表達,可能意味著南極磷蝦油的攝入,能夠促進脂肪酸的β 氧化,減少脂質積累;而ACSF2和ACSM3 均為?；o酶A 合成酶家族中的一員,分別參與不同鏈長脂肪酸的合成[22-24],其表達下調意味著南極磷蝦油可能具有抑制脂肪酸合成的作用。

本研究中,一些重要的參與脂質代謝的蛋白質在試驗組中呈上調表達,但在正常組中表達不變或下調,包括HSD17B8、HSD17B6 和LPCAT。HSD17B8 和HSD17B6 是 17β - 羥基類固醇脫氫酶(17βhydroxysteroid dehydrogenase,17β-HSDs)家族成員,參與了脂肪酸和膽固醇的代謝,對維持哺乳動物體內激素之間的平衡、調節激素生成和代謝發揮著重要的作用[25-26]。該類酶的表達及活性與性激素和脂代謝紊亂相關疾病的發病緊密相關。HSD17B8 可有效催化雌二醇、睪酮、雙氫睪酮的氧化,并可在一定程度上催化雌酮還原為雌二醇[27-28],且這兩類蛋白質均參與了類固醇的代謝過程[29]。LPCAT 在將磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)sn-2 位上的△6 去飽和酶和其他去飽和酶作用的中間產物(如GLA)轉移至?；鵆oA 庫的過程中起著至關重要的作用[30-32],該蛋白能夠調節血漿脂蛋白顆粒,對身體有良好的促進和改善作用。本研究中,試驗組中LPCAT 的上調表達表明,該蛋白對南極磷蝦油維持小鼠體內的脂蛋白含量平衡具有重要作用。由此可見,南極磷蝦油對脂質代謝的調節,不僅影響體重、血脂等指標,也可能涉及到糖代謝調節和激素合成調節。

富含磷酯型多不飽和脂肪酸的磷蝦油一直以來備受人們關注,其對提高學習記憶能力[33-34],提高免疫力[35-36],以及對肝臟功能的調節作用[37]已被廣泛論證。而磷蝦油的作用機理也被不斷地研究, 如Ferramosca 等[12]分析了肝臟線粒體中與脂肪酸合成和脂肪氧化相關的蛋白酶活性,認為磷蝦油通過維持肝臟的氧化磷酸化,起到了減輕體重的作用。Burri等[11]根據肝臟轉錄組數據發現,磷蝦油的補充使脂質和膽固醇合成途徑中的相關基因表達下調。而本研究利用蛋白質組學技術,進一步深入研究了磷蝦油對降低血脂和減輕體重的作用途徑,為揭示磷蝦油對肝臟功能的調節作用提供了數據。

4 結論

本研究以高脂模型小鼠的肝臟為對象,利用非標記蛋白質定量、功能性蛋白質網絡分析等技術手段研究了南極磷蝦油對高脂小鼠肝臟脂代謝的調控機制。根究研究推測,參與脂肪酸β 氧化的ACADSB 及參與脂肪酸合成代謝的ACSM3 和ACSF2 是南極磷蝦油調節脂代謝的重要調控蛋白質。同時,FADS2 和ELOV2在南極磷蝦油抑制脂質合成途徑中也發揮著重要作用。本研究結果在蛋白質組學層面上解釋了南極磷蝦油降血脂的作用機理,同時證實ACADSM、ACSM3、ACSF2、FADS2 和ELOV2 等蛋白質在脂代謝調控中具有重要作用。但它們的具體作用方式仍有待進一步探究。