驅動蛋白超家族18A在結直腸癌組織中的表達及意義

李 斌，馮聯忠，王春華，鮑 軼，鄭 麗，董來榮

結直腸癌的發生、發展和轉移是一個多階段、多因素及多環節的復雜動態變化過程。近年來有研究發現，驅動蛋白的異常表達可影響細胞在有絲分裂過程中遺傳物質的分配，導致子代細胞的缺陷，從而引起腫瘤的發生[1]。驅動蛋白超家族18A（kinesin family 18A）由894個氨基酸組成，分子質量約為100 ku(1.0×105)[2]，是驅動蛋白超家族的一個成員，屬于微管解聚酶Kip3家族[3]。本研究收集2016年1月—2016年6月嘉興學院附屬第二醫院手術治療的結直腸癌患者35例，從mRNA及蛋白水平檢測KIF18A在結直腸癌組織中的表達，探討KIF18A與結直腸癌臨床病理特征和預后的關系，尋求新的結直腸癌分子標記物和治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組共35例，男17例，女18例；年齡42～83歲。取手術切除的新鮮結直腸癌組織及相應癌旁正常組織（距腫瘤邊緣大于5 cm），迅速置入專用標本保存液的試管，再置入-80 ℃冰箱保存。

第2組收集2012年1月—2012年7月結直腸癌92例患者的石蠟標本。男46例，女46例。年齡30～86歲，≤60歲30例，＞60歲62例。腫瘤位于結腸48例，直腸44例。腫瘤直徑≤4 cm者51例，＞4 cm者41例。有淋巴結轉移39例，無淋巴結轉移53例。分化程度為高分化5例，中分化67例，低分化20例。TNM分期根據美國癌癥聯合委員會（AJCC）制定的第7版腫瘤分期，Ⅰ期11例，Ⅱ期41例，Ⅲ期38例，Ⅳ期2例。

另有2010年1月—2016年1月因結腸損傷等疾病接受手術治療20例（男17例，女3例；年齡37～69歲）患者的正常結直腸組織（非癌旁組織），制成組織切片，經免疫組化方法進行染色。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 隨訪 所有結直腸癌病例均經病理學檢查證實，均為第一次行結直腸癌手術,術前均未行化療、放療及其他抗腫瘤治療。術后采用門診和電話方式進行隨訪，隨訪至2017年7月6日。術后到患者因腫瘤死亡的時間為總生存時間。

1.3 試 劑 TRIzol（ 美 國 invitrogen 公 司 ）；SYBR-Green熒光染料、定量PCR試劑盒、反轉錄試劑盒（美國 ABI公司）；一抗，兔抗人KIF18A抗體（美國 Proteintech 公司）；抗兔二抗（武漢博士得生物公司）；實時熒光定量PCR引物由上海生工合成。

1.4 檢測方法 實時熒光定量PCR：按照TRIzol說明書對35對新鮮樣本提取RNA并檢測RNA完整性，然后按逆轉錄試劑盒說明書要求，逆轉錄生成cDNA。KIF18A擴增的正向引物5’-GTTCAGCCTATTCCTTGTTGCT-3’，反向引物 5’-GCACACTTTGAGTGGTGGA-3’。

擴增條件：變性階段（95 ℃， 5 min），擴展定量階段（95 ℃， 30 s、60 ℃， 60 s），共 40 個循環，繪制溶解曲線。每個樣本的檢測均重復2次，以GAPDH為內參；CT 表示目的基因的熒光值設定的閾值時的反應循環數?；蛳鄬Ρ磉_量采用公式2-△△Ct計算，分析目的基因表達量的差異。

免疫組化檢測：對組織切片樣本進行脫蠟，水化，檸檬酸抗原修復液行熱抗原修復，滅活內源性過氧化物酶，加KIF18A抗體過夜，加抗兔二抗工作液，DAB顯色，蘇木精復染，沖洗，脫水，封片。檢測結果由病理醫師雙盲閱片判定。

1.5 判斷標準 以細胞膜/細胞漿呈棕黃色細顆粒狀染色為陽性染色。染色面積：未著色為0分，少于25%為1分，25%～75%為2分，大于75%為3分；著色強度：無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩者乘積為樣本最終評分，樣本最終評分0～3分為低表達組，大于3分為高表達組[4]。

1.6 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析。計量資料比較采用配對t檢驗，采用χ2檢驗或Fisher精確概率法分析KIF18A與結直腸癌臨床病理特征的關系；生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，生存率的比較采用Log-Rank檢驗。采用Cox回歸模型進行單因素和多因素回歸分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KIF18A mRNA在結直腸癌組織及相應癌旁正常組織中的表達情況實時定量PCR 檢測結果顯示，35例結直腸癌組織及相應癌旁正常組織中的KIF18A mRNA表達量分別為4.056±0.4024和1.253±0.1438，結直腸癌組織中KIF18A mRNA的表達水平顯著高于相應癌旁正常組織(P＜0.01)。見圖 1。

圖1 35對標本中KIF18A mRNA表達差異（結直腸癌組織-癌旁正常組織）

圖2 結直腸癌及正常結直腸組織中KIF18A蛋白表達情況（免疫組化染色）

2.2 KIF18A蛋白的表達情況 免疫組化方法檢測92例結直腸癌組織及20例結直腸正常組織中KIF18A蛋白的表達，發現其主要表達于細胞質。見圖2。KIF18A蛋白在結直腸癌組織中的高表達率為80%（74/92），顯著高于結直腸正常組織中的高表達率15%（3/20，χ2= 32.741，P＜0.01）。

2.3 KIF18A蛋白的表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系 分析結直腸癌患者臨床病理特征與組織切片中KIF18A蛋白表達情況，結果發現，KIF18A蛋白高表達率與結直腸癌的浸潤深度、淋巴結轉移及pTNM分期相關（均P＜0.05）；浸潤至漿膜層、有淋巴結轉移和pTNM分期較晚的患者，結直腸癌組織中KIF18A蛋白高表達率較高；而與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位及分化程度無關（均P＞0.05）。見表1。

表1 92例結直腸癌患者臨床病理特征與KIF18A蛋白表達的關系(n，%)

2.4 KIF18A蛋白表達與結直腸癌患者累計生存率及預后的關系 對92例結直腸癌患者術后生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，行Log-Rank檢驗發現，KIF18A蛋白高表達組患者的3年生存率為54.1%，明顯低于低表達組患者的100%（χ2=15.326.0,P=0.000）。見圖3。

單因素Cox回歸模型分析提示，腫瘤大小、分化程度、浸潤程度、淋巴結轉移情況、p TNM分期及KIF18A蛋白表達水平與結直腸癌患者預后相關（P＜0.05）。因腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移與p TNM分期具有相關關系，故將患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、pTNM分期及KIF18A蛋白表達水平納入多因素Cox回歸，結果提示KIF18A蛋白表達水平、pTNM分期為影響本組結直腸癌患者預后的獨立危險因素（P=0.019、0.024）。見表 2。

圖3 KIF18A蛋白低表達與高表達結直腸癌患者生存曲線的比較

表2 影響本組92例結直腸癌患者總生存率的危險因素分析

3 討論

結直腸癌是世界范圍內常見的消化道惡性腫瘤之一。目前我國結直腸癌發病率位居所有惡性腫瘤的第6位，其死亡率為第5位，呈逐年上升趨勢[5]。其治療主要是以手術為主，包括化療、放療及靶向治療等的綜合治療[6]，但整體療效欠佳[7]。近年來靶向治療發展迅速，尋找結直腸癌新的、有效的分子標記物和治療靶點，以提高結直腸癌綜合治療水平。

近年來有研究表明，驅動蛋白超家族是細胞內重要的功能性蛋白，參與細胞器、染色體及RNA結合蛋白的轉運，在細胞的有絲分裂過程中起著重要的作用[8]。KIF18A能沿微管向正極運動，并且在微管末端發揮微管解聚酶的作用，從而調節微管長度[9]。動粒微管的長度決定KIF18A的微管解聚能力，KIF18A與姐妹染色體的中板集合及分離密切相關[10-12]。近年來有研究發現，KIF18A蛋白異常表達，將導致細胞有絲分裂過程中姐妹染色體的分離異常，引起細胞的非整倍體發生，從而誘發腫瘤[13]。有研究表明，KIF18A在細胞的有絲分裂周期中發揮重要作用，與細胞周期素B1的表達量周期相似，其表達量在細胞有絲分裂期比分裂間期明顯增多[3]。有研究發現，KIF18A在人乳腺癌中呈高表達，其高表達與腫瘤的惡性程度、轉移及預后相關[14]。有研究通過對早期肝癌中的KIF18A表達分析，發現其在肝癌組織中高表達水平與患者的不良預后相關[15]。在本研究中，我們首先通過熒光定量PCR方法，發現結直腸癌組織中的KIF18A mRNA表達水平顯著高于癌旁組織，說明KIF18A在結直腸癌組織中呈高表達。進一步通過免疫組化染色方法，對92例結直腸癌組織和20例的正常結直腸組織中的KIF18A表達水平進行了檢測，分析其與結直腸癌臨床病理特征和預后的關系。結果表明，結直腸癌組織中的KIF18A表達水平顯著高于正常結直腸組織，并且發現K IF18A 表達與結直腸癌浸潤深度、淋巴結轉移及pTNM分期有關，KIF18A在浸潤至漿膜層、有淋巴結轉移和pTNM分期較晚的結直腸癌組織中的高表達率較高。生存分析結果顯示，KIF18A高表達患者3年生存率顯著低于低表達者，說明KIF18A表達水平與患者術后生存時間有關。Cox回歸分析結果提示KIF18A蛋白表達水平為影響本組結直腸癌患者預后的獨立危險因素，進一步提示結直腸癌組織中KIF18A高表達可能不利于患者預后，是潛在的結直腸癌預后指標。

綜上所述，KIF18A在結直腸癌組織中的表達水平顯著高于正常結直腸組織。KIF18A在結直腸癌組織中的表達水平與結直腸癌浸潤深度、淋巴結轉移及pTNM分期有關。結直腸癌組織中KIF18A呈高表達，則可能提示結直腸癌患者預后不良。個人的飲食習慣、有無吸煙等不良的生活方式以及生活環境的污染等因素可能對本研究有所影響，但隨著KIF18A基因與結直腸腫瘤關系研究的不斷深入，KIF18A有望成為結直腸癌潛在腫瘤標記物和治療靶點。