α7煙堿型乙酰膽堿受體在電針減輕肢體缺血再灌注兔肺損傷中的作用

宮麗榮，董樹安，闞永星，余劍波

肢體缺血再灌注是骨科手術及嚴重肢體擠壓傷常見的病理生理過程，不僅引起肢體局部的損傷，嚴重時可引起遠隔臟器損傷，其中肺臟是最易受累的器官 。研究表明，炎性介質的大量釋放引起的炎癥反應是肢體缺血再灌注肺損傷主要的發病機制[2-3]。前期研究表明，電針刺可減輕肢體缺血再灌注誘發的肺損傷[4]，但具體作用機制并不明確。α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）是膽堿能抗炎通路的關鍵受體，參與急性肺損傷的發病過程[5-6]。本文探討α7nAChR在電針減輕肢體缺血再灌注誘發兔肺損傷中的作用。[1]

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 本研究經中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物倫理委員會批準。健康清潔級新西蘭大白兔40只，雄性，體質量1.9～2.4 kg，3月齡，中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心提供。G6805-1A低頻電子脈沖治療儀（上海華誼醫用儀器有限公司）；α-銀環蛇毒素（α-BGT，Sigma公司，美國）；戊巴比妥納（百奧萊博公司）；α7nAChR兔多克隆抗體（Abcam公司，美國）；β-actin一抗、DAB顯色試盒（Santa Cruz公司，美國）；山羊抗兔IgG二抗（北京康為世紀生物科技有限公司）；TNF-α、IL-1β及IL-6 ELISA試劑盒（R&D公司，美國）。

1.2 分組和模型制作 根據預實驗，選取40只新西蘭大白兔，采用隨機數字表法隨機分為假手術組、模型組、電針組和α-BGT組（n=10）。參照文獻[7]方法，制作肢體缺血再灌注模型。戊巴比妥納30 mg/kg 腹腔注射麻醉，仰臥位固定于特制兔臺。右頸內靜脈穿刺置管以備輸液。于兔雙后肢股動脈三角區備皮、消毒、并切開，分離出股靜脈、股動脈。以微型動脈夾于近腹股溝韌帶處夾閉股動脈3 h形成缺血期，松開無創微動脈夾，再灌注4 h形成再灌注期。假手術組只放置微型動脈夾而不夾閉股動脈。α-BGT組于模型制備前30min腹腔注射α7nAChR拮抗劑α-BGT 1 μg/kg。實驗期間持續靜脈輸注生理鹽水1.5 mL/(kg·h)。

1.3 電針刺預處理 參照中國針灸學會實驗針灸研究會制定的“動物針灸穴位圖譜”，采用特殊兔盒暴露針刺部位，選取兔雙側足三里穴（后肢背外側，脛骨粗隆下部外約0.3 cm處）和肺俞穴（背部，第3胸椎棘突下旁開約1.5 cm處）。消毒，采用直徑0.3 mm一次性無菌針灸針，直刺進針約5～7 mm接電針。選用G6805-1A低頻電子脈沖治療儀進行刺激。針刺參數設置：刺激電流l～2 mA，疏密波，頻率2/15 Hz，以兔出現輕微肌顫為宜，每次持續30 min，1次/d。電針組及α-BGT組于模型制備前1～4 d及模型制備過程中行電針刺激。

1.4 標本采集 再灌注4 h時，采集頸動脈血樣。隨后采用頸總動脈放血法處死兔，留取雙肺組織。取右肺上葉組織測定W/D比值，取部分左肺組織用10%多聚甲醛固定，取部分左肺組織液氮內速凍處理后于-80 ℃冰箱保存。

1.5 肺組織W/D比值的測定 取右肺上葉組織100 mg，紗布拭去水漬，置于精細天平上稱濕重（W），然后置于80 ℃電熱恒溫干燥箱烘干72 h。至恒重后稱干重（D），計算肺組織W/D比值。

1.6 肺損傷評分 左肺上葉組織置于10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋連續切片厚度4 μm，HE染色，封片，在光學顯微鏡下觀察病理學結果。參照文獻[8]方法進行肺損傷評分。

1.7 ELISA法檢測肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量 取部分左肺組織，制成組織勻漿，4 ℃下3000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm。取上清液，按照TNF-α、IL-1β及IL-6 ELISA試劑盒 （R&D公司，美國）說明書進行操作。測定450 nm處的吸光度值，根據標準品的吸光度值分別繪制標準曲線，計算肺組織TNF-α、IL-1β及IL-6含量。1.8 Western blotting法檢測α7nAChR蛋白表達 取-80 ℃凍存肺組織，凍融、剪碎后10000g離心15 min。按照BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取樣品10 μg蛋白經凝膠恒壓電泳、轉膜、封閉1 h，加入一抗（1:1000） 4 ℃孵育過夜。TBST清洗5次，每次5 min，加入山羊抗兔IgG二抗（1:3000）室溫孵育1 h后漂洗。TBST漂洗后，于暗室中進行顯色和曝光，采用Quantity One圖像分析軟件進行分析，以目的蛋白與內參β-actin條帶積分光密度值的比值反映α7nAChR蛋白表達水平。

1.9 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行分析，所有數據以均數±標準差（）表示，通過Ryan-Joiner法行正態性檢驗，采用雙側檢驗，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗。選取P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理學變化 檢測結果顯示（圖1、表1），灌注4 h時，假手術組兔肺組織未見明顯病理改變，模型組、電針組及α-BGT組可見不同程度炎細胞浸潤、肺泡或間質水腫、可見出血，電針組水腫、炎細胞浸潤和出血均較模型組減輕。模型組、電針組及α-BGT組的肺損傷評分明顯高于假手術組（P＜0.05），電針組的肺損傷評分明顯低于模型（P＜0.05），組α-BGT組的肺損傷評分明顯高于電針組（P＜0.05）。

2.2 肺組織W/D比值的變化 測定結果顯示，灌注4 h時，模型組、電針組及α-BGT組的W/D比值明顯高于假手術組（P＜0.05），電針組的W/D比值明顯低于模型（P＜0.05），α-BGT組 的 W/D 比 值 明 顯 高 于 電 針 組（P＜0.05）。見表1。

圖1 各組兔肺組織病理表現（HE染色×400）

表1 各組兔肺損傷評分及W/D比值的比較（n=10）

2.3 肺組織TNF-α、IL-1β及IL-6含量變化ELISA結果顯示，灌注4 h時，模型組、電針組及α-BGT組的TNF-α、IL-1β及IL-6含量明顯高于假手術組（P＜0.05），電針組的TNF-α、IL-1β及IL-6含量明顯低于模型組（P＜0.05），α-BGT組的TNF-α、IL-1β及IL-6含量明顯高于電針組（P＜0.05）。見表 2。

表2 各組兔肺組織TNF-α和IL-1β及IL-6含量的比較（pg/mg）

2.4 α7nAChR蛋白變化 Western blotting結果顯示，灌注4 h時，模型組、電針組及α-BGT組的α7nAChR蛋白表達明顯高于假手術組（P＜0.05），電針組的α7nAChR蛋白表達明顯高于模型組（P＜0.05），α-BGT組的α7nAChR蛋白表達明顯低于電針組，（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組α7nAChR蛋白表達的變化

3 討論

肢體缺血再灌注引起遠隔肺損傷發病機制復雜，其中過度的炎癥反應是最為重要的機制之一[9]。肢體缺血再灌注誘發炎性反應過程中釋放多種促炎細胞因子，其中TNF-a作為肢體缺血再灌注肺損傷時重要的促炎介質之一，是由單核/巨噬細胞和其它促炎細胞激活后釋放,其水平升高較其他細胞因子更早。它不僅產生直接的細胞毒性，還能通過中性粒細胞進一步啟動炎癥級聯反應，增加IL-1β、IL-6等其它炎癥介質的釋放，從而加重肺組織損傷[10-11]。本研究顯示，兔肢體缺血3 h 再灌注4 h后，肺組織W/D及肺損傷評分、TNF-α、IL-1β及IL-6濃度升高。說明肢體缺血再灌注繼發了肺內炎癥反應，導致肺損傷的發生。

膽堿能抗炎通路作為調節免疫系統的一種神經生理機制，主要通過迷走神經和α7nAChR調節炎性細胞因子的分泌和產生發揮抗炎效應，在多器官缺血再灌注損傷及炎癥性疾病中發揮良好的機體保護作用[5,12]。α7nAChR是煙堿型膽堿能受體的一員，廣泛分布于巨噬細胞、上皮細胞、內皮細胞等表面，是膽堿能遞質參與調節炎癥反應所必需的受體[13]。研究表明，α7nAChR可通過多條途徑抑制 TNF-α、IL-1β等炎性因子的合成和釋放從而起到抑制炎癥反應的作用[14]；特異性激活α7nAChR可通過減少炎性因子的釋放減輕肺臟、腎臟以及其它臟器炎癥反應導致的損傷[6,12]。

電針刺激具有臟器保護作用，可通過減少炎性介質釋放對臟器起免疫調節和保護作用[15]。研究表明，電針刺足三里穴和肺俞穴能夠減輕肺損傷，其機制可能與其抗氧化、減少中性粒細胞聚集的作用有關[16-17]。本研究于肢體缺血再灌注模型制備前進行電針刺預處理并參照文獻[18]方法給予α7nAChR拮抗劑α-BGT 1 μg/kg。結果表明，電針刺足三里和肺俞穴可上調兔肺組織α7nAChR的表達，并減少炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的含量，減輕兔肺損傷，而α-BGT可部分拮抗電針刺減少炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的釋放以及肺保護作用。綜合研究結果，可能提示α7nAChR表達上調減少炎性介質TNF-α、IL-1β及IL-6的釋放參與了電針減輕肢體缺血再灌注誘發兔肺損傷的過程，其它可能涉及的機制待研究。