胡亮亮
(陽信縣畜牧獸醫局,山東陽信 251800)
1982年,Maureen Howard等 在研究B細胞mIg的功能時,偶然發現PMA誘導后的EL-4細胞系上清能夠顯著增強B細胞經抗IgM抗體刺激所引發的增殖反應,因此將上清中這種物質稱為B細胞 生長因子。隨后,該物質對B細胞的其他功能相繼被發現,又被命名為B細胞刺激因子-1,1986 年,在Honjo、Lee和Arai先后克隆了鼠和人的該因子 后,國際將其統一命名為白細胞介素4,大約在同一時間,Grabstein等獲得了IL-4的氨基酸序列。Avery等在克隆雞Th2細胞因子時發現chIL-4,發表了mRNA序列Gallus gallus(AJ621249),由此正式拉開了chIL-4在分子水平上研究的序幕。
IL-4 是重要的免疫調控分子,具有多種免疫功能,了解chIL-4 在雞體內的動態變化規律,對 于禽類傳染性疾病的診斷、治療及預后判斷具有重要的臨床意義。目前尚沒有檢測chIL-4 蛋白的 試劑盒,主要是通過各種方法檢測chIL-4 mRNA,但僅僅在mRNA 水平上進行評估,還不能反 映出chIL-4 的實際水平。目前,雖然有檢測人和小鼠IL-4 的商品化試劑盒,但是由于chIL-4與 人和小鼠IL-4 的氨基酸同源性僅分別為22.48%和21.23%,所以人和小鼠IL-4 檢測試劑盒并不能 用于chIL-4 的檢測。為了解決這一問題,本研究研制了檢測chIL-4 的雙抗體夾心ELISA,為科 學研究中chIL-4 的檢測提供方法,也為進一步研究chIL-4 的免疫學功能奠定基礎,具有重要的應用價值。
將成熟chIL-4 基因亞克隆到原核表達載體上,然后在Ecoil BL21 中誘導重組蛋白的表達,提 取包涵體并復性。用復性的蛋白免疫小鼠,經過4 次免疫后,取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞(SP2/0)進行融合,經過3 次篩選與亞克隆后,最終得到穩定分泌抗chIL-4 單抗的雜交瘤細胞株。將雜交瘤細胞注入到小鼠腹腔內,從腹水中純化出單克隆抗體,然后對抗體的亞型、親和力、特異性進行鑒定,并分析其可能的抗原識別區。
對獲得的單抗進行生物素標記,將單抗依次作為ELISA 的捕獲抗體、與其識別不同抗原表位 的生物素化單抗則作為檢測抗體,篩選出最佳抗體對。然后通過一系列條件的優化,建立chIL-4 雙抗體夾心ELISA,并對該檢測方法的特異性和實用性進行初步評價。