H5、H7、H9亞型禽流感病毒三重RT-PCR檢測方法的建立

趙冬敏　吳青　趙翰飛　劉青濤　楊婧　黃欣梅　劉宇卓　韓凱凱　畢可然　李銀

摘要：根據GenBank中H5、H7、H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白（HA）編碼基因，使用DNAStar軟件比較分析篩選出特異的保守片段，設計3對引物H5-P1/H5-P2、H7-P3/P4和H9-P5/P6。在此基礎上，建立了H5、H7、H9亞型禽流感的三重RT-PCR檢測方法，本方法可同時檢測出樣品中的H5、H7、H9亞型禽流感病毒。敏感性試驗結果表明，該方法檢測H5、H7、H9亞型禽流感RNA的敏感性分別達2.80、10.50、5.73 pg/μL，該方法檢測其他相關病毒時均為陰性，具有很高的特異性，此外，該方法具有良好的重復性。利用所建立方法對240份禽流感臨床樣品進行檢測，結果與血凝試驗和血凝抑制試驗結果的符合率為100%。此診斷方法檢出時間早，且特異、敏感、經濟、快速，可普遍推廣，在禽流感診斷和防制中具有重要意義和應用價值。

關鍵詞：禽流感病毒;H5亞型;H7亞型;H9亞型;三重RT-PCR

中圖分類號：S852.65+7 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）09-0204-03

禽流行性感冒（avian influenza virus，AIV）是由正黏病毒科A型流感病毒引起的禽類烈性傳染病，其易感動物包括雞、鴨、火雞、鵪鶉等家禽及野鳥、水禽、海鳥等野禽，且對人類和低等哺乳動物也能引起嚴重的疾病，包括高致病性毒株引起的急性致死性疫病以及低致病毒株引起的產蛋下降、輕度呼吸道疾病等多種疾病[1]。禽流感病毒亞型較多，毒株變異較大，給本病的防治帶來極大困難。國際獸醫局（OIE）規定該病為A類傳染病。我國也將此病列為一類動物疫病。

研究發現H5、H7、H9是禽流感病毒中具有較強致病性的3種亞型，其中H5N1禽流感病毒對禽類的致死率通?？梢赃_到100%[2-3]。1997年，香港首次報道發生18例人感染H5N1禽流感病毒，其中6人死亡，引起了全球衛生界的廣泛關注[4]，證實了AIV可直接對人類造成威脅。2013年3月，我國上海、安徽等地發現人感染H7N9型禽流感，共造成136人感染，其中37人死亡，是全球首次發現的新亞型流感病毒[5]。自1994年首次報道雞群分離到H9N2亞型禽流感病毒以來[6]，H9亞型低致病性禽流感病毒廣泛存在于我國[7]。低致病性的H9N2亞型禽流感病毒雖然不引起感染禽類的大量死亡，但是可導致感染禽產蛋下降和免疫抑制，與其他病原共感染時常導致高死亡率，給我國養禽業造成了巨大的經濟損失[8-9]。1999年H9N2亞型禽流感在內地和香港感染人事件的發生，更突出體現了禽流感預防治療的公共衛生意義[10]。因此，快速、及時、準確地檢測出禽流感對保障國民的生命財產安全具有重要意義。

RT-PCR作為一種現代分子生物學基因診斷技術，具有高度敏感性和特異性，并可極大縮短禽流感病毒的檢出時間，能在數小時內檢出痕量病原，可克服傳統的AIV診斷技術包括病毒分離鑒定試驗周期長的缺點，為AIV早期快速診斷提供了敏感、快速、實用的方法。本試驗針對我國養禽業的主要病毒亞型H5、H7和H9，建立了H5、H7、H9的三重RT-PCR，快速診斷禽流感，進行禽流感早期診斷，疫情預測，為禽流感的防治提供有效的早期診斷技術和監測手段，同時也為高致病性禽流感防治爭取寶貴的快速反應時間。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

H9亞型禽流感病毒由筆者所在實驗室分離鑒定及序列測定。H5亞型禽流感病毒RNA及陽性血清、H7亞型禽流感病毒RNA及陽性血清均由美國密西西比州立大學萬秀峰教授惠贈。鴨坦布蘇病毒（duck tembusu virus，DTMUV），雞傳染性喉氣管炎病毒（avian infectious laryngotracheitis virus，ILTV），雞傳染性支氣管炎病毒（avian infectious bronchitis virus，IBV），減蛋綜合征病毒（egg drop syndrome virus，EDS-76）、H9亞型禽流感病毒陽性血清均由本實驗室保存。

1.2 試劑

液體病毒RNA/DNA抽提試劑盒，購自Axygen生物科技有限公司;5×AMV反轉錄緩沖液、High Pure dNTPs（10 mmol/L）、Rnase Inhibitor（40 U/μL）、反轉錄酶AMV、dNTPs（2.5 mmol/L）、Mg2+（25 mmol/L）、Ex Taq反應緩沖液（10×）、Ex Taq酶，均購自TaKaRa公司;反轉錄隨機引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank已發表的H5、H7和H9亞型禽流感病毒基因序列，分析HA基因保守區，應用DNASTAR軟件設計3對特異性引物（表1），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.4 樣品的準備

按照試劑盒說明書提取H9亞型禽流感病毒、DTMUV、IBV的總RNA。反轉錄體系：5×AMV反轉錄緩沖液4.0 μL，反轉錄隨機引物（9 mer）1.0 μL，dNTP（10 mmol/L）2.0 μL，Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，AMV反轉錄酶1.0 μL，模板RNA 11.5 μL。按如下條件將病毒RNA反轉錄成cDNA：42 ℃ 反應1 h，95 ℃反應5 min。將H5、H7亞型禽流感病毒RNA按上述反應體系和條件反轉錄成cDNA。參照試劑盒說明書，提取EDS-76、ILTV的DNA，保存于-20 ℃，備用。

1.5 單引物單模板驗證

分別以H5、H7、H9亞型禽流感病毒cDNA為模板，進行單引物單模板PCR反應，反應體系如下：總體系為25.00 μL，其中雙蒸水15.25 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，25 mmol/L MgCl2 2.00 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.00 μL，上、下游引物（50 μmol/L）各0.50 μL，模板cDNA 2.00 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性50 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30個循環;然后72 ℃延伸10 min。循環反應結束后，將擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 H5、H7、H9亞型禽流感病毒三重 RT-PCR檢測方法的建立

經過對引物比例、引物濃度、Mg2+濃度、反應時間、反應溫度等因素的反復優化，確定了H5、H7、H9亞型禽流感病毒多重PCR基本的反應體系為：雙蒸水13.25 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，25 mmol/L MgCl2 2.00 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.00 μL，H5-P1（50 mmol/L）0.50 μL，H5-P2（50 μmol/L）0.50 μL，H7-P3（50 μmol/L）0.50 μL，H7-P4（50 μmol/L）0.50 μL，H9-P5（50 μmol/L）0.50 μL，H9-P6（50 μmol/L）0.50 μL，混合病原cDNA 2.00 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL。按照“1.5”節中所述PCR程序進行反應，循環結束后將擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 敏感性試驗

測定H5、H7、H9亞型禽流感病毒RNA濃度。在此基礎上，分別進行10倍梯度稀釋，然后反轉錄成cDNA，進行三重RT-PCR方法檢測，確定該方法的敏感性。

1.8 重復性試驗

用建立的三重RT-PCR檢測方法，對3份禽流感病毒陽性樣品重復檢測3次，以驗證本方法的重復性和穩定性。

1.9 特異性試驗

取DTMUV、ILTV、IBV和EDS-76，分別提取RNA或DNA，采用三重RT-PCR進行擴增，確定本方法檢測的特異性。

1.10 三重RT-PCR方法對臨床樣品的檢測

采集江蘇地區活禽市場中雞、鴨、鵝的泄殖腔拭子和喉拭子240份，置于添加四抗的無菌PBS緩沖液中，凍融3次后，尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚，棄去24 h內死亡雞胚，于接種后120 h收集雞胚尿囊液，分別進行三重RT-PCR檢測、血凝試驗和血凝抑制試驗。

2 結果與分析

2.1 單引物單模板驗證

將H5、H7和H9亞型禽流感病毒RNA反轉錄成cDNA后，采用單引物單模板進行PCR，結果顯示，H5、H7、H9亞型禽流感病毒特異性檢測引物的目的基因大小分別為427、501、673 bp，與試驗設計相符（圖1）。

[FK（W9][TPZDM1.tif]

2.2 H5、H7、H9亞型禽流感病毒三重RT-PCR方法的建立

以H5、H7和H9亞型禽流感病毒混合cDNA為模板，同時采用3對引物進行RT-PCR擴增，經過對引物比例、引物濃度、Mg2+濃度、反應時間、反應溫度等因素的反復優化，電泳結果顯示，H5、H7和H9亞型混合模板擴增出預期大小的特異性條帶（圖2）。

2.3 敏感性試驗

禽流感病毒核酸初始質量濃度的測定結果為：H5亞型模板的質量濃度為28.0 ng/μL，H7亞型模板的質量濃度為105.3 ng/μL，H9亞型模板的質量濃度為57.3 ng/μL。將其進行101～105稀釋后進行三重RT-PCR擴增。檢測結果表明，該方法能檢測出稀釋度為104的H5、H7和H9亞型AIV（圖3）。

2.4 重復性試驗

用建立的三重RT-PCR檢測方法，對3份禽流感樣品重復檢測3次，結果均出現相同的檢測結果，表明所建立的方法具有良好的穩定性和重復性（圖4）。

2.5 特異性試驗

采用所建立的三重RT-PCR方法對幾種禽主要疫病病毒進行檢測，結果對坦布蘇病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、減蛋綜合征病毒進行RT-PCR均未出現特異擴增條帶，說明該檢測方法特異性好（圖5）。

2.6 三重RT-PCR方法對臨床樣品的檢測

采集江蘇地區活禽市場中雞、鴨、鵝的泄殖腔拭子和喉拭子240份，接種9～11日齡SPF雞胚后收集雞胚尿囊液，利用禽流感三重RT-PCR方法進行檢測，結果檢測到H5亞型禽流感病毒5份、H9亞型禽流感病毒6份，H9和H7亞型混合感染1份。所檢測結果與血凝試驗和血凝抑制試驗的結果完全符合，證明該方法可用于臨床檢測（圖6）。

3 結論與討論

禽流感病毒可引起禽類全身性或呼吸器官性傳染病。至今A型禽流感病毒的血凝素已發現16種，神經氨酸酶10種，其血清型較多，易變異[11]。病毒主要通過病禽的排泄物、分泌物和尸體等污染飲水和飼料，經消化道或傷口傳染[12]。早期快速診斷和血清學監測是預防、控制禽流感的前提條件。由于感染禽種類、年齡、性別、所處環境以及感染并發癥的不同，表現的臨床癥狀差異極大，因此，該病主要依靠實驗室診斷。

目前，禽流感的診斷技術主要有病毒分離鑒定、免疫熒光、RT-PCR、血凝抑制、瓊脂擴散、ELISA等，其中病毒分離鑒定和RT-PCR具有很高的敏感性和特異性[13]。但由于病毒分離鑒定操作繁瑣、耗時較長，因此，RT-PCR技術仍然是當前診斷禽流感的主要方法。多重PCR是在以單基因PCR為基礎上進行的發展和完善，是在同一PCR體系中加入多對特異性引物，一次同時擴增多個靶基因，實現了多基因型的鑒別和多種病原體的同時檢出，使混合感染的診斷和基因分型變得更加簡捷，減少了漏診率，提高了檢驗效率。張文慧等建立了同時檢測H5和H7亞型禽流感病毒的多重RT-PCR方法[14];陳思懷等針對NP（型診斷）、HA（亞型診斷）基因設計2對引物，從而對H5、H6、H9亞型AIV做快速檢測[15]。馬鳴瀟等針對H5和H9這2個亞型，各設計1套特異性的引物，建立了RT-PCR一步法，用于H5和H9亞型的鑒別[16]。

本研究針對我國養禽業的主要病毒亞型H5、H7和H9，設計3對特異性檢測引物，通過條件優化，建立了同時檢測H5、H7、H9亞型禽流感的三重RT-PCR方法。該方法可同時檢測H5、H7和H9亞型禽流感病毒，檢測靈敏度分別達 2.80、10.50、5.73 pg/μL，方法特異性好、重復性高，可用于快速診斷禽流感，進行禽流感早期預測。本方法的建立可為禽流感防治提供有效的早期診斷技術和監測手段，同時也為高致病性禽流感防治爭取了寶貴的快速反應時間。

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