粗葉泥炭蘚原絲體增殖條件篩選研究

尹麗娟 （上海市園林科學規劃研究院，上海市徐匯區 200232；上海城市困難立地綠化工程技術研究中心，上海市徐匯區 200232）

由于泥炭富含有機質和腐殖酸，既可直接作為栽培介質[1]，也可用作改良土壤的肥料[2]，故園藝產業的高速發展也成就了泥炭產業。但隨著泥炭產業的發展，泥炭地被過度開采，這不僅對植被分布、生態多樣性、自然碳匯功能造成嚴重破壞[3]，還導致我國由泥炭出口國逐漸成為進口國[4]。因此，亟需找到泥炭的替代品，以實現對泥炭資源的可持續利用，也可確保農業和園藝產業的高速發展。泥炭蘚（Sphagnumsp.）又稱水苔，是泥炭蘚屬植物的統稱。德國等園藝發達國家的研究表明，泥炭蘚可替代泥炭作為生長基質[5]，并已成功應用于杜鵑、歐石楠等植物的栽培中；泥炭蘚由于吸水性極強[6-8]，還可用于食品保鮮[9]、提高植物嫁接成活率[10]等方面。

苔蘚植物繁殖可分為有性生殖和無性生殖；成熟泥炭蘚孢蒴中的孢子數量為6萬～8萬[11]，在人工培養下其萌發率可達60%[12]，繁殖系數極高；但在自然條件下，由于泥炭蘚雌雄異株和受精過程過分依賴水分的特性，導致其有性生殖“衰退”[13]。因此，人為提高孢子體的利用率是泥炭蘚快速繁殖的有效途徑。有研究表明，原絲體階段是泥炭蘚有性生殖的必經階段，且原絲體可獨立生活，在苔蘚生活史中占有重要地位；關于泥炭蘚原絲體的報道大多集中在原絲體形態結構學方面的研究[13-16]，在泥炭蘚的組織培養方面，僅有研究報道了三種泥炭蘚原絲體在不同氮磷濃度、溫度、光照條件下的發育狀況[17]，且沒有進行生長量化方面的描述，無法得知泥炭蘚原絲體最佳生長條件；李大華[18]和姜山[19]等人雖研究了培養基種類、糖類、酒石酸銨、微量元素對不同種類泥炭蘚莖尖生長的影響，但對泥炭蘚原絲體快速增殖的相關研究還未見報道。因此，本研究以粗葉泥炭蘚（Sphagnum squarrosum）無菌原絲體為材料，對培養基、pH、碳源和生長調節劑種類及濃度對其生長量的影響進行研究，以期找出泥炭蘚原絲體快速增殖的途徑，從而提高泥炭蘚的園藝產量，為泥炭蘚在園藝產業中的應用奠定基礎?，F將相關試驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

帶有孢蒴的粗葉泥炭蘚植株采集于新疆喀納斯，選擇飽滿、帶柄的成熟孢蒴，在自來水下沖洗4 h后，轉移至超凈工作臺上，用75%酒精消毒30 s、無菌水清洗3 次，然后用0.5%次氯酸鈉（NaClO）消毒1 min，再用無菌水清洗干凈后，擠破孢蒴，接種在knop 液體培養基上培養10 d 待用。

1.2 試驗設計

培養基篩選試驗：設培養基分別為BCD、Beneck（簡稱BM）、Knop（簡稱KM）、MS、1/2MS、1/4MS，以清水為對照。

培養基pH篩選試驗：以Beneck為基本培養基，培養基的pH 分別設置為4、5、6、7、8。

碳源篩選試驗：以Beneck 為基本培養基，添加濃度分別為0、5、10、20、40 g/L 的葡萄糖或蔗糖，以不加糖為對照。

生長調節劑篩選試驗：以Beneck為基本培養基，添濃度分別為 0.1、1、10 μmol/L 的 IBA 和 6-BA，以不添加任何生長調節劑為對照。

過濾無菌泥炭蘚原絲體，并用無菌水反復沖洗后，在18 000 r/min 條件下打碎，制成均勻的懸浮液，加入到以上培養基中，培養分為液體懸浮培養和固體培養，培養條件均為溫度25 ℃、光周期16 h/8 h。培養20 d 后，稱量原絲體生長量，計算增殖倍數。

計算公式：增殖倍數=（處理原絲體干重-對照原絲體干重）/對照原絲體干重。

1.3 數據處理與分析

數據采用Origin 7.5 和DPS 數據處理系統14.1進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 培養基篩選

由圖1可知，粗葉泥炭蘚在兩種培養方式下，各培養基的增殖倍數均有差異。其中，Beneck 培養基和Knop 培養基最有利于粗葉泥炭蘚原絲體的增殖；不同濃度的MS培養基上粗葉泥炭蘚原絲體增殖效果差異不顯著，但濃度越高繁殖越慢。說明粗葉泥炭蘚原絲體適合在配方簡單、鹽度較低的培養基中生長，故以下試驗均以Beneck 培養基為基本培養基。

圖1 不同培養基種類對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的影響

2.2 pH篩選

培養基的pH 決定了泥炭蘚原絲體生長的酸堿環境。由圖2可知，在兩種培養方式下，均以培養基pH 為5～6時，粗葉泥炭蘚原絲體的增殖效果較好；培養基pH 為4時，兩種培養方式的粗葉泥炭蘚原絲體的增殖效果有所差異，以采用液體懸浮培養的增殖效果較好，且采用固體培養的泥增蘚原絲體的殖效果顯著低于培養基pH為5～6時。以上結果表明，弱酸環境適宜泥炭蘚原絲體的增殖，而中性至弱堿性環境不利于泥炭蘚原絲體的增殖，且pH 越高，其長勢越差。

圖2 不同pH對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的影響

2.3 碳源篩選

由圖3可知，粗葉泥炭蘚在無碳源的培養基中可以生長，但加入碳源后，其生長勢明顯增強。在兩種培養方式下，蔗糖對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的促進作用均非常明顯，而葡萄糖對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的促進作用以采用固體培養為優；采用液體懸浮培養時，蔗糖和葡萄糖的最佳濃度為5～10 g/L，采用固體培養時，蔗糖和葡萄糖的最佳濃度為10～20 g/L，這說明采用液體懸浮培養粗葉泥炭蘚原絲體對糖的敏感程度更高。以上結果表明，培養基中添加中低濃度碳源可促進泥炭蘚原絲體的增殖，但隨著碳源濃度的升高，對增殖的促進作用逐漸降低。

此外，試驗中還發現，在不同碳源的固體培養基上，有少量泥炭蘚配子體分化現象出現。

圖3 碳源對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的影響

2.4 生長調節劑篩選

由圖4可知，兩種生長調節劑均對粗葉泥炭蘚原絲體的增殖有一定影響，且以采用液體懸浮培養的增殖效果優于采用固體培養。采用液體懸浮培養時，添加IBA 對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的促進作用不明顯，且高濃度的IBA 會抑制粗葉泥炭蘚原絲體的增殖；采用固體培養時，以低濃度（0.1 μmol/L）的IBA 對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的促進作用較好。在兩種培養方式下，添加6-BA均有利于促進粗葉泥炭蘚原絲體的增殖，且以低濃度的促進作用更為明顯。

圖4 激素對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的影響

2.5 培養方式篩選

由以上結果可知，在兩種培養方式的不同試驗條件下，粗葉泥炭蘚原絲體的增殖存在差異。經相關性分析，液體懸浮培養和固體培養的粗葉泥炭蘚原絲體的增殖結果呈極顯著相關，相關系數為0.771**（n=31，R=0.449），這說明培養方式對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的影響不大，培養方式并不是粗葉泥炭蘚原絲體的增殖結果差異的主要來源，而培養基的種類、pH 及添加物才是結果差異的原因所在。

3 結論與討論

試驗結果表明，粗葉泥炭蘚原絲體的增殖生長受多個因素的影響，在無碳源和無生長調節劑的培養基中，粗葉泥炭蘚原絲體也可以生長，但增殖效果不佳，在實際生產中的應用意義不大；而在培養基中加入碳源和生長調節劑或改變pH后，粗葉泥炭蘚原絲體的增殖效果有顯著變化，這有助于提高泥炭蘚的園藝產量。在本試驗條件下，低鹽度的Beneck 和Knop 培養基較為適宜粗葉泥炭蘚原絲體的增殖，且培養基的最佳pH 為5～6；碳源是提高粗葉泥炭蘚原絲體增殖效果的關鍵因子，其中，蔗糖較葡萄糖更有利于促進粗葉泥炭蘚原絲體的增殖，且以低濃度蔗糖的促進作用更為顯著；高濃度IBA和6-BA 均會抑制粗葉泥炭蘚原絲體的增殖，低濃度的6-BA 則能促進粗葉泥炭蘚原絲體的增殖。

在培養基篩選試驗中發現，苔蘚培養常用的BCD 培養基及不同濃度的MS 培養基均不適宜用于粗葉泥炭蘚原絲體的增殖，這與前人的研究結果一致。例如，李大華[20]在多紋泥炭蘚莖尖培養中發現，采用MS 培養基不利于其萌發，以采用Beneck 和Knop培養基的多紋泥炭蘚萌發株數最多；付素靜[21]和于傳梅[22]等發現，尖葉匐燈蘚和短月蘚均以在Beneck 和Knop 兩種培養基上的增殖系數最大，而在MS 培養基上則生長較差，甚至變黃。由此可知，多數苔蘚植物在高鹽度的培養基上緩慢甚至受到抑制，而在相對簡單的培養基上生長良好。

在培養基pH篩選試驗中發現，粗葉泥炭蘚原絲體在pH 較低的培養基上增殖效果較好，以pH 5～6 較為適宜，隨著培養基pH 的升高，粗葉泥炭蘚原絲體的增殖逐漸減少，甚至停止，這與泥炭蘚人工培養的試驗結果一致。例如，泥炭蘚配子體在pH為6.0時生長速度最快[23]，說明泥炭蘚喜偏酸性環境，這也與泥炭蘚自然生境為偏酸性土壤相吻合。

在碳源篩選試驗中發現，添加碳源能極大地促進粗葉泥炭蘚原絲體的增殖，采用固體培養的最佳碳源濃度為10～20 g/L，較采用液體懸浮培養高，推測是由于液體懸浮培養條件下的培養基與粗葉泥炭蘚原絲體的接觸更加緊密，從而對糖濃度更加敏感所致，這也與前人的研究結果相一致。例如，姜山[24]發現糖是泥炭蘚生長最主要的因子，且以培養基中添加5 g/L 葡萄糖時其生長最佳；李大華[18]在三種泥炭蘚配子體固體培養中發現，添加20～25 g/L 蔗糖是其生長的最佳條件。同時，本試驗在加入碳源的固體培養基上發現了粗葉泥炭蘚的配子體，經分析，根據泥炭蘚原絲體的生長規律，第20天左右為葉狀原絲體階段[25]，接著會逐漸分生為芽體，即配子體的初始形態，這與梁書豐[26]的研究結果一致，他在真蘚培養過程中也發現，固體培養更有利于真蘚原絲體的分化。

生長素主要促進細胞伸長，而細胞分裂素主要促進細胞分裂和擴大[27]。在生長調節劑篩選試驗中發現，細胞分裂素6-BA 對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的促進作用大于生長素IBA，由此可以判斷，粗葉泥炭蘚原絲體的增殖方式偏向于細胞橫向分裂及分支，而不是縱向伸長。同時，在兩種培養方式下，粗葉泥炭蘚原絲體采用液體懸浮培養的激素響應濃度也低于采用固體培養，推測這也是由于液體懸浮培養條件下培養基與粗葉泥炭蘚原絲體的接觸面積較固體培養的大而引起。